Viral Concentración Determinación A través de placa Ensayos: El uso de tradicionales y novedosos sistemas de superposición

El objetivo general de este procedimiento es determinar la concentración viral mediante la cuantificación de partículas infecciosas contando placas discretas en cultivo celular. Esto se logra primero sembrando células para formar una monocapa confluente destinada a la infección. El segundo paso consiste en realizar diluciones seriadas de la muestra viral desconocida que se desea cuantificar. A continuación, se infectan las monocapas confluentes utilizando las diluciones seriadas del inóculo viral, seguido por la aplicación de una capa sobrepuesta inmovilizadora. El paso final es fijar y teñir las placas tras el tiempo de incubación adecuado para el virus en cuestión, con el fin de contar las placas discretas. En definitiva, los ensayos de placas pueden utilizarse y modificarse de diversas maneras para determinar los títulos virales de una muestra viral desconocida.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la capa intermedia semisólida, es que su aplicación y eliminación son mucho más sencillas tanto en aplicaciones de alto rendimiento como tradicionales. Además, no se requiere calentar los reactivos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la investigación de muchos virus líticos diferentes, ya que el uso de una capa intermedia líquida en formato de placa de 96 pocillos permite el cribado rápido de compuestos terapéuticos novedosos, lo que puede reducir considerablemente las largas horas pasadas en el laboratorio realizando ensayos tradicionales de placas.

El día anterior al ensayo, siembre las células adecuadas para el virus en cuestión con el fin de alcanzar una confluencia del 90 al 100% el día de la infección. Las soluciones stock también pueden prepararse el día anterior al ensayo. Primero, prepare una solución fijadora de formaldehído al 10% en agua destilada mezclando 5,56 mililitros de formaldehído stock al 36% con 14,44 mililitros de agua destilada. Luego, prepare la tinción de violeta de cristal compuesta por violeta de cristal al 1% en etanol al 20%, diluido con agua destilada. A continuación, trabajando bajo condiciones estériles, prepare el medio de placas 2x adecuado para el tipo de células que se están utilizando. Filtre la solución a través de un filtro de 0,2 micrones si alguno de los reactivos no es estéril. Para preparar una capa líquida para usar en el ensayo de placas, añada 2,4 gramos de Avicel a un matraz que contenga 97,6 mililitros de agua destilada que se esté mezclando rápidamente con una barra de agitación. Mezcle la solución a temperatura ambiente hasta que se vuelva demasiado viscosa para la barra de agitación. En este punto, transfiera el matraz a un agitador orbital y agite vigorosamente durante 30 minutos para asegurar una homogeneización uniforme. Finalmente, esterilice la solución en autoclave a 121 grados Celsius y 14 PSI durante 30 minutos.

Y cuando el programa haya finalizado, almacene sellado a temperatura ambiente. Para una capa superior de agarosa, prepare una solución stock de agarosa al 0,6 % en agua destilada, mezcle con una barra de agitación y autóclave para disolver. Para una capa superior de carboximetilcelulosa, prepare una solución de carboximetilcelulosa al 2 % en agua destilada y mezcle. Luego autóclave como antes.

Al día siguiente de la siembra, utilice un microscopio invertido para verificar la confluencia y viabilidad de las células antes de comenzar el ensayo. Asegúrese de que las células presenten una morfología celular estándar y una confluencia aproximada del 90 %.

Realice una dilución seriada por diluciones decimales de las muestras infecciosas en medio de crecimiento celular, variando el número de diluciones necesarias según el título esperado del virus en cuestión. Además, prepare una muestra control no infectada para garantizar independientemente la viabilidad celular y ayudar en la identificación de las placas. Pipetee la muestra control no infectada y la dilución seriada en los pocillos de la placa, teniendo cuidado de no perturbar la monocapa.

Utilice un volumen suficiente de inóculo para cubrir las células, manteniendo el volumen lo más bajo posible para maximizar el contacto vírico con la monocapa. Coloque las placas en el incubador de cultivo de tejidos e infecte las células durante 45 minutos a una hora. Cada 20 minutos, agite suavemente las placas para asegurar una cobertura uniforme y evitar que la monocapa celular se seque.

Durante la infección, prepare la solución de trabajo para recubrimientos líquidos. Mezcle a partes iguales medio para placas tibio y Stock de Avicel al 1,2 a 2,4% a temperatura ambiente para obtener una solución de trabajo con un medio de recubrimiento de Avicel al 0,6 a 1,2%. Para recubrimientos de agarosa o CMC, mezcle a partes iguales medio para placas tibio y una solución stock de agarosa al 0,6% calentada o CMC al 2%, respectivamente. Luego, coloque la mezcla en un baño de agua a 56 grados Celsius durante 30 minutos para lograr la equilibración térmica. Asegúrese de que la solución esté tibia pero no caliente al tacto, para evitar la muerte celular y la reducción de los títulos virales. Después de la infección, aplique los recubrimientos sobre las monocapas infectadas. Tras la adición del recubrimiento, incube las placas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante dos a 14 días, según el virus que se esté analizando.

Para fijar las células con una capa líquida, deseche o aspire la capa de Avicel y luego agregue solución de formaldehído al 10% en los pocillos, dejando fijar a temperatura ambiente durante 30 minutos hasta toda la noche. Para agarosa o CMC, agregue directamente la solución de formaldehído sobre la capa durante una hora hasta toda la noche a temperatura ambiente. Después de la fijación, deseche el formaldehído y luego retire manualmente los tapones semisólidos de agarosa con la espátula.

Lave las placas celulares de Avicel con agua para eliminar el fijador residual de la capa antes de la tinción.

Cubra las células con una cantidad mínima de solución de violeta de cristal durante aproximadamente 15 minutos. Agite suavemente las placas si es necesario para asegurar una cobertura uniforme. Lave cuidadosamente el colorante violeta de cristal con agua. Una vez fijadas, teñidas y secas, almacene las placas indefinidamente para su análisis futuro. Cuente las placas en cada pocillo, excluyendo aquellos con menos de cinco o más de 100 placas. Tome el promedio de cualquier réplica técnica de la misma dilución. Tenga en cuenta el tamaño y la morfología de las placas. Determine la titulación viral de la muestra original tomando el número promedio de placas para una dilución y el inverso del factor de dilución total.

Esta imagen muestra comparaciones del recubrimiento de placas del virus de la fiebre del Valle del Rift utilizando placas de 12 pocillos. Las células Veros se sembraron a 2,5 veces 10 a la quinta células en placas de 12 pocillos e infectaron con 200 microlitros usando la misma muestra inicial diluida en serie del MP 12. Tras la infección, se aplicaron recubrimientos de 1,5 mililitro de agarosa al 0,3%, Avicel al 0,6% o CMC al 1% para comparar directamente los recubrimientos. Este histograma muestra los resultados de los conteos de placas y las titulaciones para los tres recubrimientos. Aquí se muestran comparaciones del recubrimiento de placas del VEEV utilizando placas de 12 pocillos. Las células Veros se sembraron como antes e infectaron con un volumen de 200 microlitros usando la misma muestra inicial diluida en serie de la cepa vacunal VEEV-TC 83; tras la infección, se aplicaron recubrimientos de 1,5 mililitro de agarosa al 0,3%, Avicel al 0,6% o CMC al 1% como antes.

Nuevamente, el histograma muestra los resultados de los conteos de placas y la titulación para los tres recubrimientos. Esta imagen muestra un ejemplo de recubrimientos de placas de alto rendimiento. Una placa de 96 pocillos con células Veros sembradas a tres veces 10 a la cuarta células por pocillo se infectó con 50 microlitros de inóculo utilizando la misma muestra inicial del virus de la fiebre del Valle de Rift MP 12 diluida en serie, durante una hora y en cuadruplicado. Para los recubrimientos, se probaron concentraciones finales del 0,6 y 1,2 % de Avicel cell con el fin de determinar la viabilidad y la reproducibilidad del uso de recubrimientos líquidos de manera de alto rendimiento. Este histograma muestra las titulaciones determinadas a partir de cada recubrimiento.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que cada virus es diferente y que pueden ser necesarias optimizaciones, como el uso de diferentes tipos celulares, tiempos de incubación y/o medio de crecimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo de placas básico utilizando recubrimientos líquidos y semisólidos.