Utilizando Impedancia Cell-sustrato y imágenes de células vivas para medir los cambios en tiempo real en la adhesión celular y De-adhesión inducidas por Matrix Modificación

El objetivo general del siguiente experimento consiste en cuantificar cambios rápidos en la adhesión célula-matriz en células endoteliales expuestas a agentes modificadores de la matriz en tiempo real, utilizando impedancia célula-sustrato e imágenes de células vivas. En este experimento, se emplea la enzima hémica mieloperoxidasa como agente modificador de la matriz con relevancia fisiopatológica. Esto se logra primero recubriendo las superficies con fibronectina para proporcionar un sustrato matricial adhesivo.

Se permite entonces que la mieloperoxidasa o MPO se una a la fibronectina. A continuación, se siembran células endoteliales en suspensión sobre las superficies y se incuban para lograr la máxima adhesión y expansión celular sobre la fibronectina. Luego, las células se exponen a peróxido de hidrógeno con el fin de iniciar la oxidación de la fibronectina mediada por MPO.

Los cambios rápidos subsiguientes en la adhesión celular a la matriz se cuantifican entonces en tiempo real mediante análisis de impedancia célula-sustrato y de imágenes de células vivas. Los resultados muestran que las pérdidas rápidas en la adhesión de células endoteliales a la matriz, desencadenadas por la oxidación de fibronectina mediada por NPO, pueden cuantificarse en tiempo real con alta resolución temporal y de manera libre de marcadores mediante la impedancia célula-sustrato y el análisis de imágenes de células vivas. La ventaja de estas técnicas es que pueden cuantificar continuamente los cambios en la adhesión celular a la matriz con alta resolución temporal, lo que significa que pueden proporcionar nuevas perspectivas importantes sobre cómo las modificaciones de la matriz inducen cambios descendentes en la morfología celular y en los procesos de señalización dependientes de la adhesión.

Los protocolos tienen una importancia más amplia en el sentido de que pueden adaptarse fácilmente sustituyendo la MPO por otros agentes modificadores de la matriz, como la matriz para compuertas, proteasas, o utilizando tipos celulares adherentes distintos de las células endoteliales, como las células epiteliales. Para comenzar, añada 80 microlitros por pocillo de fibronectina para recubrir matrices microelectroquímicas de oro de 96 pocillos para mediciones de impedancia celular en sustratos, o añada dos mililitros de fibronectina a placas de cultivo celular con fondo de vidrio para análisis de imágenes de células vivas. Incube las matrices y/o las placas de cultivo a 37 grados Celsius durante dos horas.

Luego, para bloquear las superficies, agregue BSA al 0,2 % e incube a 37 grados Celsius durante dos horas adicionales. A continuación, agregue mieloperoxidasa humana purificada en HBSS e incube durante 30 minutos. Luego, use HBSS para lavar las superficies dos veces y eliminar cualquier MPO no unida.

A continuación, siembre 250.000 células por mililitro de células endoteliales en suspensión preparadas según el protocolo descrito en el texto, sobre matrices microelectrodo de impedancia para sustrato celular de 96 pocillos con superficies recubiertas de fibronectina nativa o que presente MPO. Para los platos de cultivo celular de 35 milímetros con fondo de vidrio, agregue dos mililitros de una suspensión con 500.000 células por mililitro. Inmediatamente después de sembrar las células, coloque las placas con matrices microelectrodo sobre el puerto del incubador de impedancia para sustrato celular a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono.

Y tome lecturas en blanco para iniciar la adquisición continua de datos de índice celular. Transfiera las placas de cultivo celular de 35 milímetros con fondo de vidrio a un incubador con 5% de dióxido de carbono a 35 grados Celsius. Incube durante dos horas para permitir la máxima adhesión y expansión celular.

Después de la incubación, detenga temporalmente las lecturas del índice celular y retire brevemente la placa de matriz de microelectrodos o retire el recipiente con fondo de vidrio del incubador, aspire el sobrenadante y agregue HBSS tibio para examinar los efectos de inhibidores, moduladores de MPO, reacciones catalizadas o inhibidores de la señalización celular. Añádalos a los cultivos. En este momento, coloque inmediatamente la placa de matriz de nuevo en el puerto del incubador o el recipiente con fondo de vidrio en el incubador, y permita que las células se equilibren durante 30 minutos.

Para iniciar la oxidación de fibronectina y la desadhesión celular dependiente de ácido hipocloroso catalizada por NPO para estudios de impedancia celular, retire la placa de matriz de microelectrodos del incubador y detenga las mediciones del índice celular. Añada peróxido de hidrógeno al HBSS y mezcle suavemente mediante pipeteo repetido; inmediatamente, vuelva a colocar la matriz de microelectrodos en el puerto del incubador y reinicie las lecturas del índice celular para estudios de imágenes en células vivas utilizando placas de vidrio de 35 milímetros de fondo. Tras retirar la placa del incubador, colóquela sobre una platina calentada a 37 grados Celsius de un microscopio confocal invertido, equipado con un objetivo acuático de 63 x.

Y óptica DIC Para grabar películas de células vivas, enfoque las células y optimice la óptica DIC según las pautas referenciadas aquí. Inicie la película DIC y registre lecturas basales de células no tratadas durante un minuto; luego agregue peróxido de hidrógeno y mezcle suavemente mediante pipeteo repetido, vuelva a enfocar el microscopio y continúe grabando películas DIC de las células tratadas durante el período de tiempo requerido. Para analizar los datos de impedancia célula-sustrato, comience exportando los datos a una hoja de cálculo para la adhesión celular.

Los estudios normalizan los datos estableciendo en uno los valores registrados inmediatamente antes del inicio de la oxidación de fibronectina mediada por MPO, y presentan los datos como gráficas del índice celular normalizado frente al tiempo para analizar los datos de imágenes de células vivas. Abra películas de imágenes de células vivas en contraste de interferencia diferencial (DIC) grabadas inmediatamente antes y después del inicio de la oxidación de fibronectina mediada por MPO en un programa de análisis de imágenes como ImageJ, utilizando al menos dos películas DIC independientes; seleccione aleatoriamente múltiples células y mida su área proyectada en cuadros secuenciales trazando manualmente el borde de su membrana y cuantificando el número de píxeles encerrados. Finalmente, presente los datos como una gráfica del área celular normalizada frente al tiempo. La adhesión de suspensiones de células endoteliales sobre fibronectina o fibronectina portadora de MPO da como resultado una adhesión y expansión celular máxima dentro de dos horas, según lo indicado por la estabilización de los valores del índice celular en el sustrato celular.

Las mediciones de impedancia, una vez establecida la adhesión celular máxima sobre fibronectina nativa o portadora de NPO, muestran que la oxidación dirigida de la fibronectina mediada por el ácido hipocloroso catalizado por NPO y desencadenada por la adición del sustrato coadyuvante de NPO, peróxido de hidrógeno, provoca una disminución rápida del área de contacto entre la célula y la matriz, medida mediante la impedancia célula-sustrato y mediante imágenes de células vivas. Como se muestra aquí, la desadhesión celular rápida evidente en las células endoteliales unidas a fibronectina portadora de NPO en respuesta al tratamiento con peróxido de hidrógeno no se observa en células tratadas únicamente con peróxido de hidrógeno. La inhibición de la función del motor de miosina II con la estatina BLE inhibe la velocidad de desadhesión celular endotelial medida por la impedancia célula-sustrato y mediante imágenes de células vivas, lo que indica que la desadhesión celular y la contracción en respuesta a la oxidación matricial subcelular catalizada por MPO están impulsadas por fuerzas tensiles de acto-miosina. Dado que estos métodos pueden medir con precisión cambios muy rápidos en la adhesión celular, pueden proporcionar información crítica sobre las relaciones causales entre los cambios en la adhesión y los cambios posteriores en los procesos de señalización dependientes de la adhesión, como la fosforilación de SARK o la señalización en las adhesiones focales, que pueden medirse fácilmente en experimentos paralelos a lo largo del tiempo mediante inmunotransferencia (Western blotting).