Los métodos para aumentar la sensibilidad de alta resolución de fusión polimorfismo de nucleótido único Genotipado de la Malaria

El objetivo general del siguiente experimento de fusión de alta resolución es aumentar la sensibilidad de la detección de alelos mutantes presentes a bajas concentraciones con muestras individuales. Esto se logra preparando primero el ADN extraído diluyendo la plantilla a los volúmenes y concentraciones necesarios. El segundo paso es preparar los ensayos con proporciones asimétricas del cebador directo e inverso para aumentar el producto de la sonda de plantilla.

Después de preparar las reacciones, la temperatura de recocido se establece entre las temperaturas de fusión de la sonda cuando se une al tipo salvaje o a la plantilla mutante. El paso final es analizar los productos amplificados en la plataforma de gestión de recursos humanos adecuada. En última instancia, el sesgo de amplificación de alelos mutantes y la PCR asimétrica basada en sondas permiten una detección más sensible de mutaciones SNP desafiantes a bajas concentraciones presentes en las muestras.

Este aumento de la sensibilidad es útil para la vigilancia de mutaciones en poblaciones. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes como el melting estándar de alta resolución o el genotipado tac man, es que permite una mayor sensibilidad para los alelos presentes a bajas concentraciones, y también permite el genotipado de SNPs situados proximales entre sí en el genoma. Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre la propagación de la resistencia a los medicamentos en el parásito de la malaria.

También se puede aplicar a otros sistemas, como la vigilancia de otros tipos de enfermedades infecciosas como el VIH o la detección de variantes raras de cáncer en una población de células. La demostradora del procedimiento será Caitlin Durphy. Un técnico de nuestro laboratorio.

Las plantillas para la fusión de alta resolución o HRM se preparan a partir de muestras de plasmodium falciparum obtenidas directamente de la sangre de pacientes que participan en estudios de campo. Las muestras pueden almacenarse en papel de filtro, en pruebas de detección rápida o como muestras de glóbulos rojos granulados, también se pueden adaptar al cultivo para crecer in vitro. Algunas cepas de laboratorio estándar para análisis se pueden pedir en el centro de recursos de investigación y referencia para la malaria Las muestras de reactivos pueden extraerse de sangre entera, glóbulos rojos o papel de filtro, o usarse directamente de glóbulos rojos granulados o cultivo para la amplificación directa de glóbulos rojos granulados.

Primero determine el parámetro de los glóbulos rojos utilizando un frotis fino siguiendo el procedimiento de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades. Los glóbulos rojos con paras superiores al 0,5% se diluyen uno a 400. En la TE se utilizarán tres microlitros de glóbulos rojos diluidos por cada reacción de cinco a 10 microlitros, debido a la variabilidad entre uno, los controles positivos y negativos siempre deben incluirse en los análisis de HRM.

Prepare diluciones de 10 picogramos a 10 nanogramos por un microlitro de plásmido o patrones con genotipos de corte verificados por secuencia como trolls positivos. Utilice agua de grado PCR como control negativo sin plantilla para las reacciones de amplificación. Comience este procedimiento preparando 10 existencias de trabajo de los cebadores y sondas.

El mismo protocolo se aplica a los ensayos que utilizan placas de 96 pocillos, placas de 384 pocillos, tiras de ocho tubos o capilares de vidrio. Pero para el propósito de esta demostración, solo se utilizarán placas de 96 pocillos y capilares de vidrio. Esta tabla muestra las concentraciones recomendadas de 10 veces el material de trabajo, así como las concentraciones finales para el genotipado de HRM basado en sonda bloqueada.

Prepare mezclas de reacción para cada uno. Bueno, agregue un microlitro de cada uno de los 10 cebadores y sondas de avance y retroceso de material de trabajo. Cuatro a cinco microlitros de la mezcla maestra HRM, un microlitro de agua de plantilla y de grado PCR para un volumen total de reacción de 10 microlitros.

Haz lo mismo con cada capilar de vidrio. Cubra las placas y los capilares de vidrio. Utilice sellos de placa óptica para la amplificación a base de placa y tapas de plástico para sistemas capilares.

Asegúrese de que la cobertura sea completa y que las placas y tapas estén completamente selladas y aseguradas para evitar la evaporación. Durante la amplificación. Gire las muestras para eliminar las burbujas de aire.

Haga girar las placas en una centrífuga de mesa durante tres minutos a 1.800 veces G.Gire los capilares de vidrio en un pico fuge durante 10 a 15 segundos. Coloque la placa de reacción y los capilares de vidrio en una sonda de bloqueo estándar o protocolos de amplificación MAAB que funcionen con un termociclador. Después de la amplificación por PCR, proceda al análisis de fusión desde la interfaz del software del sistema.

Derrita la placa de 40 grados Celsius a 80 grados Celsius para producir picos de fusión de sondas y amplicones. El primer paso del análisis de fusión en el ciclador de luz cuatro 80 es la normalización a partir de la derivada negativa de la fluorescencia normalizada con respecto a la vista de temperatura. Mueva las barras de normalización para rodear la región de fusión de la sonda.

La región de fusión de la sonda es la temperatura más baja de las dos regiones de fusión. Las barras de normalización deben estar en la base de los picos de fusión. Después de la normalización, seleccione calcular grupos para asignar automáticamente muestras a grupos si es necesario, reasignar manualmente muestras a grupos específicos.

Seleccione muestras que no se amplificaron o que tengan picos de fusión irregulares. A continuación, vaya a nueva llamada y seleccione negativa. Después de seleccionar las muestras mal clasificadas restantes, vaya a una nueva convocatoria, seleccione la agrupación adecuada y haga clic en aplicar cambiar Asignar genotipos para cada grupo en función de los estándares.

Después de confirmar que los grupos calculados son correctos, seleccione editar nombres de grupos en la pestaña de agrupación. Introduzca los genotipos de los patrones en el cuadro de color correspondiente. Por ejemplo, si el 3D estándar siete tiene un genotipo C conocido y está en el grupo uno, todas las muestras del grupo uno tienen resultados de prensa de genotipo C y los genotipos se muestran junto a las muestras.

Por último, exporte los resultados como un archivo TXT para un análisis posterior de la población de muestra. Una vez finalizada la ejecución en el ciclador de luz 2.0, registre los nombres y las posiciones de las muestras en los datos de la muestra Antes de comenzar el análisis, etiquete los controles negativos y los genotipos de los patrones de fusión. Comience el análisis de fusión seleccionando el análisis, eligiendo el genotipado en el análisis de la curva de fusión y el prensado. Bien.

Para aumentar la sensibilidad de la agrupación automática, seleccione todas las muestras para que la visualización en las curvas de fusión se represente. Deslice la barra de normalización hasta el límite superior de los picos de fusión de la sonda. Confirme que las muestras se han agrupado correctamente seleccionando individualmente cada grupo debajo del nombre del grupo.

Exporte los genotipos de cada muestra seleccionando todas las muestras, copiando los datos y pegándolos en una hoja de cálculo. El gráfico de la derivada negativa de la fluorescencia normalizada con respecto a la temperatura suele ser la forma más sencilla de visualizar los picos de fusión y determinar los genotipos. Si se establece la ventana de análisis solo en una región de sondeo, se obtiene una clara diferenciación de los picos correspondientes a SNP específicos.

Las coincidencias perfectas dan como resultado picos de fusión más altos indicados en rojo. Mientras que los desajustes de SNP tienen temperaturas de fusión más bajas, indicadas en gris cuando ambos alelos están presentes en una muestra. El análisis HRM basado en prob representa ambos alelos como dos curvas de picos que se muestran en naranja con picos que coinciden con muestras de alelos individuales que se muestran en rojo y gris, la reducción progresiva de la temperatura de ealing durante la amplificación da como resultado un sesgo hacia el alelo mutante representado por el pico del lado izquierdo en una muestra poligenómica o polialélica.

Este sesgo de amplificación de alelos mutantes da como resultado una sensibilidad de HRM para detectar alelos menores presentes en menos del 1% en muestras poligenómicas o polialélicas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la calidad de la muestra es clave. Pequeñas diferencias en las concentraciones de tampón pueden desplazar las curvas de HRM.

El uso de controles es una forma útil de estandarizar los resultados. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar la PCR asimétrica basada en prob y el sesgo de amplificación de alelos mutantes para genotipar de manera precisa y sensible los SNP de malaria a partir de una variedad de tipos de muestras.