In Situ caracterización de proteínas hidratadas en agua por Salvi y TOF-SIMS

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar películas de proteínas adsorbidas en soluciones acuosas, utilizando el Sistema de Análisis en la Interfase Líquido-Vacío y la espectrometría de masas de iones secundarios por tiempo de vuelo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre biomoléculas y la biointerfase. Por ejemplo, la caracterización de proteínas adsorbidas en una superficie sólida.

Las principales ventajas de esta técnica son que las biomoléculas pueden ser iniciadas in situ en un entorno líquido y en combinación con el mapeo molecular. Aunque este método puede proporcionar información sobre las biomoléculas en la interfaz sólido-líquido, también puede aplicarse a otros sistemas, incluyendo el estudio de células cancerosas individuales, interacciones de fármacos y la adhesión de biopelículas. En una jeringa de cinco mililitros, aspire dos mililitros de una solución de etanol al 70 %.

Conecte la jeringa al extremo de entrada del dispositivo SALVI e inyecte lentamente un mililitro del líquido durante un período de 10 minutos. Al final de la inyección, retire la jeringa y conecte la entrada y la salida del SALVI utilizando un conector de polieter-éter-cetona. Mantenga el microcanal del SALVI lleno con la solución de etanol al 70 % a temperatura ambiente durante cuatro horas.

Luego, llene una segunda jeringa con agua desionizada estéril. Conéctela a la entrada del SALVI e inyecte lentamente el agua desionizada en el dispositivo durante un período de 10 minutos. Retire la jeringa y vuelva a conectar la entrada y la salida del dispositivo entre sí.

Para inmovilizar una película de proteína, comience aspirando dos mililitros de solución de fibronectina en una jeringa. Conecte la jeringa a la entrada del dispositivo SALVI e inyecte lentamente un mililitro del líquido durante un período de 10 minutos. A continuación, retire la jeringa y vuelva a conectar la entrada y la salida.

Incube el montaje en una placa de cultivo limpia a temperatura ambiente durante 12 horas. Tras la incubación, inyecte lentamente un mililitro de agua estéril desionizada durante un período de 10 minutos y luego reconecte la entrada con la salida. Para comenzar, coloque la platina de ToF-SIMS sobre una superficie plana y limpia.

Coloque el dispositivo SALVI sobre la platina con la oblea de silicio y la membrana de nitruro de silicio orientadas hacia arriba. Fije el dispositivo SALVI a la platina utilizando cuatro piezas metálicas de sujeción, y atornille las piezas metálicas que sostienen las esquinas del dispositivo en la placa metálica mediante cuatro tornillos. A continuación, enrolle suavemente el tubo de PFTE conectado al canal microfluídico.

Utilice cuatro piezas metálicas y cuatro tornillos para sujetar la parte rígida. Asegúrese de que el dispositivo esté colocado en el espacio abierto del portamuestras, de modo que no interfiera con el haz de iones primario durante el análisis. A continuación, monte la copa de Faraday en el portamuestras utilizando un tornillo.

A continuación, abra la puerta del compartimento de carga del ToF-SIMS y coloque la platina horizontalmente sobre la plataforma de carga antes de cerrar la puerta. Encienda la bomba de vacío y deje que la cámara del compartimento alcance un vacío de aproximadamente 10 a la menos seis milibares. Luego, después de unos 30 minutos, una vez que el vacío se haya estabilizado, mueva el dispositivo SALVI a la cámara principal.

Ajuste el haz de iones primario y el analizador del ToF-SIMS para obtener una resolución espacial de aproximadamente 400 nanómetros, siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. A continuación, localice el canal microfluídico utilizando el microscopio óptico. Utilice el centro de la imagen óptica como referencia y alínelo para que coincida con el centro de la imagen de iones secundarios.

La demostración visual de este paso es fundamental, ya que es difícil de aprender debido a que la muestra es más gruesa que las muestras sólidas normales, y es complicado ajustar la configuración para encontrar el mejor enfoque del canal. Antes de cada medición, utilice un haz de oxígeno de un kiloelectrónvoltio para escanear la ventana de nitruro de silicio durante aproximadamente 15 segundos con el fin de eliminar la contaminación superficial. Asimismo, utilice una pistola de electrones para compensar la acumulación de carga superficial durante todas las mediciones.

A continuación, seleccione el modo positivo o negativo antes de iniciar la adquisición de datos. Utilice el bismuto de 25 kiloelectrónvoltios tres más como haz de iones primario en todas las mediciones. Para el perfilado en profundidad, escanee el haz de iones primario en un área redonda con un diámetro de aproximadamente dos micrómetros con una resolución de 32 píxeles por 32 píxeles.

Para minimizar el tiempo necesario para perforar la membrana de nitruro de silicio, utilice un haz de iones primario con un ancho de pulso largo. Después de la perforación de la membrana de nitruro de silicio, mantenga la misma corriente durante aproximadamente 200 segundos para obtener datos suficientes para reconstrucciones de imágenes bidimensionales. Para la recopilación de datos, reduzca el ancho de pulso a 80 nanosegundos con el fin de adquirir espectros con mejor resolución de masa.

Continúe esta adquisición durante aproximadamente otros 200 segundos. Mediante la interfaz microfluídica SALVI, el haz iónico primario puede bombardear directamente la película hidratada de fibronectina. Un número de agregados de agua y fragmentos de aminoácidos se indican mediante los datos del espectro de masas ToF-SIMS.

Esto proporciona evidencia directa de la propiedad de las moléculas de agua que rodean y se encuentran dentro de las moléculas de proteína hidratadas. Aquí se puede observar la serie temporal del perfil de profundidad de la película de fibronectina hidratada y del agua desionizada. Las intensidades de los iones secundarios seleccionados son despreciables antes de que la membrana de nitruro de silicio sea perforada.

Una vez que la membrana de nitruro de silicio se perfora, las intensidades de los iones secundarios aumentan significativamente. El proceso de corta duración del pulso se utiliza para obtener datos con mejor resolución de masa para las reconstrucciones de imagen y espectro. Las imágenes 2-D de la película de fibronectina hidratada y del agua desionizada representan los conteos de iones secundarios seleccionados provenientes de la muestra.

Cuanto más brillante es la imagen, mayor es el número de iones secundarios. Estas imágenes intuitivas permiten una comparación clara de iones secundarios seleccionados entre diferentes muestras, lo cual es útil en el análisis de datos. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que un microreactor debe estar libre de fugas antes de instalarlo en la cámara de vacío.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología y las biointerfases exploraran la adsorción de proteínas, la adhesión de biopelículas, monocapas ensambladas sobre superficies y muchos otros fenómenos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar diversas muestras líquidas utilizando SALVI y el ToF-SIMS en estado líquido.