Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

El objetivo general de este procedimiento es amplificar por PCR los sitios de integración retroviral a partir de ADN genómico masivo y secuenciar la biblioteca de ADN resultante, de modo que se puedan mapear ubicaciones de integración precisas en un genoma de referencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en retrovirología básica y clínica mediante el análisis de la distribución de los sitios de integración en todo el genoma del huésped. La principal ventaja de esta técnica es la profundidad de secuenciación del ADN y el hecho de que se pueden multiplexar muchas muestras en una sola secuenciación.

Un día antes de la transfección, coloque 3,3 veces 10 a la sexta HEK293T células en 10 mililitros de Dulbecco's Modified Eagle's Medium suplementado en cada una de las cinco placas de 100 milímetros. Al día siguiente, utilice reactivos de transfección disponibles en el mercado o fosfato de calcio para transfectar las células con 10 microgramos de plásmido portador de clones moleculares retrovirales de longitud completa o nueve microgramos de vectores de una sola ronda elididos, más un microgramo de una construcción de expresión de VSV-G. Agregue la mezcla a los medios de la celda gota a gota.

Después de la transfección, incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo celular humidificada con 5% de dióxido de carbono. Después de aproximadamente 48 horas, recoja los medios celulares que contienen virus con una pipeta volumétrica y páselos a través de un filtro de 0,45 micras por flujo de gravedad. A continuación, concentrar el virus por ultracentrifugación a 200.000 G durante una hora a cuatro grados centígrados.

Después de la centrifugación, retire el sobrenadante hasta que queden aproximadamente 500 microlitros de DMEM FPS y vuelva a suspender la pastilla del virus. Añadir 20 unidades de DNasa e incubar durante una hora a 37 grados centígrados. Determine la concentración de p24 utilizando un kit de captura de antígeno p24 del VIH-1 de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El día antes de la infección, coloque la placa 3,0 veces 10 al quinto HEK293T células en 2,5 mililitros de DMEM FPS por pocillo en una placa de seis pocillos e incube durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos. Infectar las células con una concentración final de p24 viral de 500 nanogramos por mililitro en 500 microlitros de DMEM FPS fresco. Incubar durante dos horas en una incubadora de cultivo de tejidos.

Después de dos horas, agregue dos mililitros de DMEM FPS precalentado a 37 grados centígrados a cada pocillo y devuelva la placa a la incubadora. 48 horas después de la infección, retire el medio y lave las células con dos mililitros de solución salina tamponada con fosfato. Coseche las células añadiendo 0,5 mililitros de tripsina-EDTA precalentado a 37 grados centígrados y, después de unos segundos, inspeccione visualmente los pocillos en busca de desprendimientos celulares.

A continuación, añada dos mililitros de DMEM FPS precalentado y vuelva a suspender las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta volumétrica. Transfiera la solución a un matraz de cultivo de tejidos de 75 centímetros cuadrados que contenga 18 mililitros de DMEM FPS precalentado y devuélvalo a la incubadora de cultivo de tejidos. Un mínimo de cinco días después de la infección, recoja las células como antes y vuelva a suspender en cinco mililitros de DMEM FPS precalentado mediante pipeteo.

Centrifugar la solución durante cinco minutos a temperatura ambiente a 2.500 Gs, luego aspirar y desechar el sobrenadante. Por último, extraiga el ADN genómico de la célula utilizando un kit disponible en el mercado. Eluir el ADN de la columna de intercambio iónico suministrada con 200 microlitros de Tris-HCL milimolar a pH 8,5.

Después de la sonicación del ADN genómico, purifique el ADN sonicado utilizando un kit de purificación de PCR. A continuación, repare el ADN con un kit de reparación de extremos. Después de la purificación del ADN como antes, A cola el ADN usando la enzima Klenow Exo-Minus.

Alternativamente, para la fragmentación por digestión de endonucleasas de restricción, corte el ADN genómico con un cóctel de enzimas que generan salientes de 5'TA, así como una enzima incompatible como BglII que se escinde aguas abajo de la LTR viral aguas arriba. Corta 10 microgramos de ADN genómico en un volumen final de 100 microlitros. Incubar durante la noche a 37 grados centígrados.

Asegúrese de que el ADN final se limpie con el kit de purificación de PCR. El enlazador que se va a utilizar con el ADN sonicado debe contener un saliente T 3' compatible, mientras que el enlazador para el ADN digerido por MseI debe contener un saliente 5'TA compatible. Comience recociendo 10 micromolares de las hebras de enlace corto y largo en 35 microlitros de tampón Tris-HCL EDTA calentando a 90 grados Celsius y enfriando lentamente a temperatura ambiente en pasos de un grado Celsius por minuto.

A continuación, prepare al menos cuatro reacciones de ligadura paralelas por muestra de ADN genómico que contenga 1,5 micromolares ligados al enlazador, un microgramo de ADN fragmentado y 800 unidades de ADN ligasa T4 en un volumen final de 50 microlitros. Deje reposar durante la noche a 12 grados centígrados. En el caso de las muestras preparadas por sonicación, se digiere la reacción de ligadura purificada con una enzima de restricción que se escinde aguas abajo de la LTR aguas arriba.

Use 100 unidades de la enzima apropiada en las condiciones recomendadas por el fabricante durante la noche. Asegúrese de que los productos finales se purifiquen mediante un kit de purificación de PCR. Prepare la primera ronda de PCR con los reactivos que se muestran aquí.

Ejecute la primera ronda de PCR utilizando los siguientes parámetros: 94 grados Celsius durante dos minutos, seguido de 30 ciclos de 94 grados Celsius durante 15 segundos, 55 grados Celsius durante 30 segundos, 68 grados Celsius durante 45 segundos. Termina con 68 grados centígrados durante 10 minutos. Agrupa las reacciones de la primera ronda y purifica el ADN como antes.

A continuación, prepare la segunda ronda de PCR que contiene los reactivos que se muestran aquí. Utilice los mismos parámetros de ciclo que para la primera ronda de PCR. Después de agrupar y purificar el ADN de la reacción de la segunda ronda, realice el control de calidad y la secuenciación de próxima generación, y analice los sitios de integración utilizando las instrucciones detalladas en la parte escrita del protocolo.

Los sitios de integración de bibliotecas preparados por digestión con enzimas de restricción, como se muestra a la izquierda, o sonicación, como se muestra a la derecha, se alinearon utilizando un software de logotipo web. Cada dilución en la serie de valoración se representa, desde el ADN puro en la parte superior de la figura, hasta la dilución máxima de uno a 15.625 en la parte inferior. El grado de certeza disminuye con el aumento de la dilución del ADN de la célula infectada.

Esta imagen muestra el logotipo de la secuencia para el control aleatorio emparejado de 50.000 sitios genómicos únicos. Tenga en cuenta que los sitios aleatorios alineados a partir del conjunto de datos del MRC, por el contrario, no lograron generar niveles apreciables de preferencias básicas. Una vez dominadas, las bibliotecas de sitios de integración se pueden preparar a partir de ADN genómico en tres días.

Por lo tanto, el mapeo del sitio de integración, desde la infección inicial hasta la bioinformática completa, se puede completar en aproximadamente dos semanas. Siguiendo este procedimiento, se pueden catalogar miles o incluso millones de sitios de integración retroviral únicos, y se pueden realizar diversos análisis para cuantificar las asociaciones entre los sitios de inserción y las anotaciones genómicas.