Fluorescencia microscopia de Selección y secuenciación de próxima generación: Herramientas útiles para la identificación de genes implicados en la integridad de los Orgánulos

El objetivo de este experimento es identificar el gen o los genes responsables de la integridad morfológica y funcional de los orgánulos vegetales. Esto se logra primero añadiendo sulfonato de etilo metano como agente químico para inducir mutaciones en semillas atópicas que portan el marcador fluorescente de orgánulos. El segundo paso consiste en recolectar semillas de plantas individuales de la primera generación mutagénica para cultivar líneas de la generación mutante subsiguiente M2.

A continuación, se observan las semillas mutagénicas de Eliana mediante un microscopio confocal o fluorescente para identificar el fenotipo organolárico aberrante. El paso final consiste en generar la tercera generación mutagénica y confirmar la presencia del fenotipo mutante. En última instancia, la mutación recesiva puede localizarse utilizando herramientas de secuenciación de nueva generación.

Una vez identificada la ubicación del gen mutante, la transformación con el gen de tipo silvestre debería restaurar el fenotipo organelar aberrante. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el mantenimiento de la integridad morfológica y funcional de los orgánulos vegetales. El tratamiento de semillas atop sta con sulfonato de atil induce cambios de timina en citosina en el genoma, lo que resulta en la conversión de citosina a guanina por timina.

Añadir mutaciones. El tratamiento con EMS es un paso clave en este protocolo para garantizar una proporción perfecta de mutaciones en individuos M dos. Para comenzar, obtener semillas de Arabidopsis del ecotipo silvestre Columbia que hayan sido previamente modificadas genéticamente para portar un marcador fluorescente de orgánulos relevante.

Transfiera 0,8 gramos o aproximadamente 40.000 semillas a un tubo cónico de 50 mililitros. Luego agregue 25 mililitros de agua destilada y 0,2 % de etil metanosulfonato. Incube la mezcla durante 16 horas en un mezclador mutagénico a baja velocidad; tras la incubación, aspire el líquido y deseche en un frasco que contenga hidróxido de sodio uno molar.

Para inactivar el EMS, agregue 25 mililitros de agua al tubo Falcon que contiene las semillas. Cierre el tubo e inviértalo cinco veces para lavar las semillas. Una vez que todas las semillas se hayan sedimentado, aspire el agua y deséchela en el matraz que contiene hidróxido de sodio uno molar.

Repita este paso de lavado hasta 10 veces después del lavado final, dejando las semillas en una cantidad mínima de agua. Proceda a la esterilización de las semillas añadiendo 25 mililitros de lejía al 10 % y agitando vigorosamente durante 30 segundos. Una vez que las semillas se depositen en el fondo, vierta la lejía y enjuague con 25 mililitros de agua estéril.

Tras la eliminación del agua estéril, añada 25 mililitros de etanol al 70%. Agite los tubos durante 30 segundos y deje que las semillas sedimenten en el fondo. Vierta el etanol y enjuague con 25 mililitros de agua estéril.

Repita el lavado con agua estéril dos veces. Luego vierta las semillas sobre una placa de Petri de plástico que contenga papel de filtro de tres mm. Deje secar las semillas bajo la campana después de incubarlas durante dos días a cuatro grados Celsius.

Coloque las semillas en una placa de Petri de 150 milímetros con aproximadamente 250 a 300 semillas por placa en medio Magi y scoog al medio con gelificante fighter. Como agente gelificante, cultive las semillas de la generación M1 en placas durante dos semanas. Transplante las plántulas al suelo y permita que las plantas continúen creciendo.

Después de 30 a 45 días, las plantas alcanzarán la etapa madura en la que se pueden observar claramente las fugas maduras. En este punto, recolecte dos semillas M de plantas M1 individuales para generar 1000 líneas M2 independientes. Con el fin de observar las plántulas con un microscopio confocal o de fluorescencia, cultive 60 semillas de cada línea M2 durante siete a 10 días en placas de Petri de plástico a la mitad.

En el medio Moreish y scoog que contiene gel de fighter, cultive también cinco plántulas del control no tratado con EMS en la misma placa. Una vez que las plántulas hayan crecido, monte de cinco a diez extremos de cos con el lado del sello ABAC hacia la lente de 40 aumentos sobre un portaobjetos y cúbralo con un cubreobjetos; bajo fluorescencia, observe cada oleína desde la región cortical hasta la medial para detectar una distribución subcelular alterada del marcador de orgánulos. Tras el trasplante de las plantas positivas al suelo y el cultivo de las plántulas tal como se describió anteriormente, confirme que el fenotipo mutante está presente en la generación M tres.

Elimine las mutaciones de fondo contaminantes mediante retrocruzamientos al menos tres veces con un genoma de tipo silvestre que contenga el marcador fluorescente organular deseado, como se describe en el protocolo escrito. Para comenzar el mapeo, utilice el kit mini planta cogen DN Easy Z para extraer aproximadamente tres microgramos de ADN genómico de M tres, que representa el ADN homocigoto mutante de Columbia. Envíe este ADN para secuenciación en el analizador genómico Illumina dos catorce.

El siguiente paso consiste en cruzar el mutante zago de Colombia con Las Berger para generar la progenie en la que, tras la autopolinización, pueda darse la combinación deseada. Se obtendrá así la generación homocigótica y, finalmente, una población de mapeo que contenga el gen de interés responsable de la mutación. Al comparar el ADN genómico de esta población con el ADN genómico de plantas de tipo silvestre, se podrá identificar la ubicación de la mutación en el genoma.

Después del crecimiento de las plantas F dos, reúna entre 70 y 100 individuos F dos que presenten el fenotipo aberrante y la misma cantidad de plantas F dos con fenotipo silvestre; recolecte un disco foliar de cada planta utilizando un perforador circular. El disco foliar debe obtenerse de hojas de la misma edad. Para asegurar cantidades similares de ADN, las muestras pueden procesarse para la extracción genómica por separado o en grupos.

En este caso, es posible recolectar de cinco a 10 muestras para cada tubo eppendorf, de modo que haya menos tubos de los cuales se deba extraer ADN genómico. Utilice el kit de purificación de ADN de hojas de plantas Master Pure para extraer el ADN genómico. El ADN genómico obtenido de cada muestra puede luego cuantificarse con un NanoDrop.

Luego, combinar cantidades iguales de ADN de cada muestra hasta un total de 300 nanogramos, manteniendo separadas las muestras mutantes y de tipo salvaje para preparar primero la reacción de marcado; añadir 60 microlitros de solución aleatoria de cebadores 2,5 x y 42 microlitros de agua. Después de desnaturalizar el ADN a más de 95 grados Celsius durante cinco a 10 minutos, enfriar las muestras en hielo para desnaturalizar el ADN. Añadir 15 microlitros de 10 X DN tps.

Mezcle con biotina DCTP y complete con tres microlitros. Glen polimerasa. Incube las muestras durante toda la noche a 25 grados Celsius.

Al día siguiente, añada 15 microlitros de acetato de sodio tres molar y 400 microlitros de etanol frío al 100 %. Incube las muestras mezcladas a menos 80 grados Celsius durante una hora tras la centrifugación a 20.500 ×g durante 15 minutos. Lave el precipitado con 500 microlitros de etanol frío al 75 % tras una segunda centrifugación.

Seque los pellet de ADN a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Re suspenda los pellet en 100 microlitros de agua y utilice cinco microlitros para verificar el rendimiento y la calidad en un gel bio. Las reacciones de etiquetado con cebadores aleatorios se cargaron en un gel de agarosa al 1% proveniente de un grupo de plantas F2 de tipo silvestre y de un grupo de plantas F2 mutantes.

Como paso final, envíe 95 microlitros de la reacción de marcado del tipo silvestre y mutante para hibridación con el microarreglo genómico arabidopsis ath1. Después de que el escáner realiza la lectura, los archivos CL puntuales resultantes se analizan utilizando nuestro software. Tras instalar nuestro software, abra el programa y pegue la cadena bioconductor que aparece en el procedimiento escrito.

Luego presione la tecla de retorno, lo que instalará los paquetes estándar de BIOCONDUCTOR desde el sitio web de matrices, genotipificación y mapeo. Descargue y descomprima los archivos enumerados en el texto en una nueva carpeta del escritorio. Mantenga los datos obtenidos del experimento con el chip génico para el tipo silvestre C, L y el mutante C. Ahora copie los datos del chip génico para el tipo silvestre C y el mutante C en la carpeta.

A continuación, abra R en una computadora con sistema Windows. Haga clic en Archivo y luego en Cambiar directorio. Seleccione la carpeta que contiene los archivos, haga clic en Archivo, Cargar espacio de trabajo y luego seleccione A one V five R data open read C do R utilizando el Bloc de notas, copie todo el texto a R. Para una Mac, haga clic en Mis y luego en Cambiar directorio de trabajo.

Seleccione la carpeta que contiene los archivos. Haga clic en cargar espacio de trabajo y seleccione el archivo de datos ATH uno V cinco R. De manera similar, abra tanto SFP R como MAP R usando un editor de texto, copie el texto y péguelo en R en la ventana de la consola.

Aparecerá un mensaje para buscar genes en el recurso de información sobre Arabidopsis o TAIR. Copie y pegue el enlace que aparece en el texto en el navegador de internet. Aparecerá una ventana que pedirá abrir o guardar el archivo.

Seleccione guardar. Elija un nombre de archivo y adjunte la extensión. Haga x ls.

Luego haga clic en guardar. Aquí se muestra un resultado típico esperado. Después de analizar los datos obtenidos del microarreglo genético del genoma de Arabidopsis H uno, esta figura representa un ejemplo de mapeo de la mutación Columbia cero utilizando el microarreglo genético de Arabidopsis, una hibridación del genoma H uno, donde las barras horizontales representan los umbrales de detección.

La mutación en este ejemplo se encuentra en el cromosoma uno, delimitado por barras verticales. Abra el archivo dot XLS para encontrar la coordenada del mutante dentro del área mapeada. En las lecturas ensambladas de Illumina del genoma mutante, identifique transiciones específicas de EMS entre los polimorfismos de un solo nucleótido.

Una vez dominado, el enfoque descrito en este protocolo puede utilizarse para mapear genes en un período breve, en comparación con el método de mapeo clásico.