In Vitro El desmontaje de virus de influenza A cápsides por centrifugación en gradiente

El objetivo general de esta centrifugación por gradiente de velocidad es analizar los capsidos del virus de la influenza A en condiciones que imitan el entorno endocítico que los virus entrantes encuentran durante la entrada celular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo se desensamblan los capsidos del virus de la influenza A durante la entrada celular, como el efecto específico de un pH ligeramente ácido en la estabilidad del capsido. La principal ventaja de esta técnica es que permite el análisis cuantitativo del proceso de desencapsidación del virus de la influenza A bajo condiciones experimentales definidas.

Además de proporcionar información sobre cómo se inicia la desencapsulación del virus de la influenza A, este método también puede aplicarse al estudio de otros virus con envoltura que tengan mecanismos de desencapsulación relacionados. Demostrando el procedimiento, estará Firat Nebloglu, un antiguo estudiante de mi laboratorio. Después de preparar los tampones y reactivos en stock según el protocolo descrito, para cada condición de pH a probar, prepare una mezcla maestra de tampón con detergente mezclando nueve mililitros de cloruro de sodio uno molar, seis mililitros de NP40 al 10 %, 2,4 mililitros del stock de inhibidor de proteasas 25X y nueve mililitros de agua doblemente destilada.

Luego, para cada condición de pH, pipetee 4,4 mL de la mezcla maestra en un tubo cónico de 50 mL. Para valores de pH superiores a 5,8, agregue 0,6 mL de la solución stock de Tris 500 mM ajustada al pH respectivo al tubo. Para valores de pH de 5,8 y menores, agregue 0,6 mL de la solución stock de MES 500 mM ajustada al pH respectivo.

Prepare cinco mililitros de solución tampón, que contenga cloruro de sodio 300 miliMolar, inhibidor de proteasa 2X, Tris 60 miliMolar, ajustado a pH 7,4, y agua doblemente destilada. Esta solución servirá como tampón de gradiente sin detergente. A continuación, añada cinco mililitros del stock al 50 % de glicerol a cinco mililitros de las mezclas de tampón con y sin detergente, obteniendo seis soluciones diferentes de glicerol al 25 %.

Utilice tiras de pH para verificar los valores de pH. Prepare una solución de glicerol al 15% mezclando una proporción de tres a siete de la solución stock de glicerol al 50% con agua destilada. Utilizando una jeringa de cinco mililitros y una aguja, agregue tres mililitros de la solución de glicerol al 15% a seis tubos de ultracentrifugación transparentes.

Lave la aguja con agua doblemente destilada después de cada paso. Utilice una jeringa de cinco mililitros y una aguja larga para inyectar cuidadosamente 3,4 mililitros de solución de glicerol al 25% debajo de la capa de glicerol al 15%, teniendo cuidado de no mezclar las dos capas. Se observa claramente una interfase entre ambas capas.

Repita esto para las seis condiciones a probar con las soluciones de glicerol ajustadas al pH respectivo. A continuación, en una cabina de seguridad biológica de clase II, utilice un mililitro de líquido alantoideo clarificado y diluido, que contenga el virus de la influenza A, para cubrir suavemente los gradientes de glicerol. Transfiera los tubos a las cubetas del rotor, equilibre los tubos opuestos y colóquelos cuidadosamente en un rotor de ultracentrifugación SW-41 previamente enfriado.

Centrifugar a 2100 rpm y 12 grados Celsius durante 150 minutos. Después de la centrifugación, utilice una pipeta Pasteur limpia y un aspirador para eliminar cuidadosamente ambas capas de glicerol. Luego, resuspenda completamente el precipitado con 40 mililitros de tampón de muestra LDS 1X no reductor, pipeteando hacia arriba y hacia abajo antes de transferir la muestra a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros.

Para realizar el SDS-PAGE, caliente todas las muestras a 95 grados Celsius durante 10 minutos. Cargue 20 microlitros de los pellet disueltos en un gel mini Bis-Tris de gradiente preformado y corra a 200 voltios durante una hora en tampón de electroforesis MOPS SDS 1X. Incube el gel en solución fijadora durante una hora.

Lave una o dos veces con agua y tiña durante la noche en una placa de cultivo celular de 15 centímetros con un volumen suficiente de solución de Coomassie coloidal, agitando suavemente a temperatura ambiente. Desmanche el gel con agua doblemente destilada, reemplazando el líquido cada 15 a 20 minutos hasta que el fondo del gel se vuelva transparente. Almacene el gel en agua doblemente destilada a cuatro grados Celsius hasta que se escanee para la cuantificación de las bandas.

Finalmente, escanee el gel con alta resolución y utilice un software personalizado disponible comercialmente para la cuantificación de las intensidades de las bandas proteicas. Reste la señal de fondo de una región cercana a las bandas respectivas y normalice los valores respecto a los valores del control sin detergente. En este experimento, la cepa X31 derivada de líquido alantoideo clarificado fue sometida a centrifugación en gradiente de velocidad a niveles de pH entre 7,4 y 5,0 y analizada mediante electroforesis SDS-PAGE.

Sin la presencia de detergente en el gradiente, los viriones intactos se sedimentan como se observa en el patrón característico de bandas, que representan HA, NP y M1 en el gel teñido con Coomassie. Al agregar NP40 a la capa inferior de glicerol, la envoltura viral, incluyendo HA, NA y M2, se solubilizó y únicamente el core viral se sedimentó en el precipitado durante la ultracentrifugación. A partir de un pH inferior a 6,5, la proteína M1 se pierde progresivamente de la fracción del precipitado, alcanzando un mínimo entre pH 5,8 y pH 5,4.

Por debajo de pH 5,8, los vRNP se disociaron y, por lo tanto, se perdieron en el sobrenadante. A partir de las bandas proteicas analizadas, se revelaron dos umbrales de pH distintos para la desensambladura de la capa de M1 y la disociación de los complejos de vRNP, incluyendo pH 6,5 y pH 5,8, respectivamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que, dependiendo de la cepa o mutante particular del virus de la influenza A, pueden observarse propiedades de desensambladura diferentes.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la microscopía electrónica para obtener información adicional, como la estructura de los capsidos del virus de la influenza aislados.