Desarrollo de un modelo de colitis impulsado por el antígeno para el Estudio de la presentación de antígenos por células presentadoras de antígenos a las células T

El objetivo general de este modelo de colitis impulsada por antígenos es determinar si los fagocitos mononucleares positivos para CX3, CR1 interactúan y activan las células T positivas para CD4 durante la colitis específica de antígeno y si esta expansión de las células T efectoras dependientes de fagocitos mononucleares ocurre dentro de la lámina propia intestinal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la enfermedad inflamatoria intestinal, como qué tipos de interacción ocurren entre las células presentadoras de antígenos y las células T efectoras en la lámina propia del colon. La principal ventaja de esta técnica es que permite estudiar la interacción de las células inmunitarias y los elementos que conducen a la patogenicidad de la enfermedad inflamatoria intestinal.

Este método utiliza el modelo de colitis por transferencia de células T, en el que las células T CD4 naïve específicas del antígeno fluorescente rojo se transfieren al huésped inmunodeficiente, expresando la proteína fluorescente verde en células mononucleares. La transferencia celular se sigue con la sonda oral de las bacterias que expresan antígeno fluorescente azul. Los eventos inmunológicos que tienen lugar en la lámina propia intestinal de los huéspedes se pueden monitorear en varias etapas del desarrollo de la enfermedad.

Use tijeras de disección para abrir el colon longitudinalmente y lave el tejido en una placa de Petri que contenga 25 mililitros de PBS para eliminar cualquier residuo y mucosidad. Cortar el colon en trozos de cinco a ocho milímetros y colocar los fragmentos resultantes en 20 mililitros de DPBS fresco sin calcio y magnesio, suplementado con diez milimolares HEPES y cinco milimolares de EDTA. Agite el tubo con la muestra durante 30 segundos a velocidad máxima.

A continuación, incubar a 37 grados centígrados durante diez minutos agitando suavemente para eliminar el epitelio. Al final de la incubación, vuelve a vórtice durante 30 segundos. Luego, deseche el sobrenadante que contiene las células epiteliales.

Transfiera las piezas de tejido a un nuevo tubo que contenga 20 mililitros de tampón PBS, HEPES y EDTA frescos, y repita la incubación con los pasos de vórtice antes y después. Después de la tercera repetición, se eliminan todas las células epiteliales y el sobrenadante queda claro. Lave los fragmentos de tejido suavemente en PBS para eliminar las células epiteliales residuales.

Cortar los fragmentos de tejido en trozos de dos por dos milímetros y transferir los trozos para su digestión en diez milímetros de medio RPI, suplementado con 0,5 miligramos por mililitro de colagenasa tipo ocho y diez unidades por mililitro de ADNasa uno. Agite las muestras durante 30 segundos. Luego, incubar las piezas de tejido a 37 grados centígrados agitando durante 30 a 35 minutos y agitar el tubo cada cinco minutos durante la incubación.

Cuando se digiere el tejido, cuele la suspensión resultante a través de un colador de células de 70 micras en un tubo cónico de 50 mililitros. Lave el colador de celdas una vez y gire la suspensión de una sola celda por centrifugación. Finalmente, lave las celdas una vez en PBS y centrifuga.

A continuación, determine el número de células viables por exclusión de azul de tripano. La proteína fluorescente cian, la proteína e. coli productora de ovoalbúmina, activa la producción de interferón gamma en las células OT-II in vitro, en contraste con la e.

coli que expresan CFP solamente. Las imágenes confocales 3D ex vivo del tejido colónico de ratones transgénicos que expresan proteína verde fluorescente, alimentados con óvulos de PCFP de E. coli, demuestran la presencia de las bacterias que expresan proteínas fluorescentes dentro de las criptas colónicas cerca de las células epiteliales intestinales y colocalizadas con los fagocitos intestinales del huésped.

En los animales rojos OT-II, las células T CD4 positivas se caracterizan por su coexpresión de proteína roja fluorescente y V beta cinco punto uno. Cuando se les desafió con óvulos de E. coli PCFP, los ratones transgénicos que expresan proteínas fluorescentes verdes deficientes en BNT y que han sido trasplantados adoptivamente con células T positivas para el ligando CD62 CD62 rojo positivo de OT-II pierden peso corporal rápidamente y desarrollan signos clínicos de colitis.

Siete días después de la transferencia celular, solo unos pocos fagocitos del huésped han muestreado óvulos de PCFP de E. coli y no se detectan células rojas positivas para OT-II. 14 días después de la transferencia de células, los fagocitos del huésped que han muestreado la e.

Los óvulos de PCFP de coli se encuentran muy cerca de los glóbulos rojos positivos OT-II transferidos adoptivamente. A los 21 días después de la transferencia de células, un gran número de células huésped han tomado muestras de los óvulos de PCFP de E. coli y los glóbulos rojos OT-II del donante, que se encuentran dispersos por toda la lámina propia del colon, están en estrecho contacto con los fagocitos intestinales del huésped.

Cuando se domina, esta técnica se puede completar en cuatro horas si se realiza correctamente. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la tinción de los linfocitos intestinales y el análisis de citocinas séricas, para responder preguntas adicionales sobre el estado de activación de las células T CD4 y confirmar la gravedad de la colitis. Después de cada desarrollo, esta técnica allana el camino para la investigación en el campo de la inmunología para explorar los pequeños eventos que conducen a la enfermedad inflamatoria intestinal en el modelo de ratón.

Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de cómo aislar las células inmunitarias de la lámina propia del colon para el análisis ex vivo posterior.