Disección y preparación del segmento Coronal de desarrollo de hipófisis de ratón

El objetivo general de este procedimiento es lograr secciones coronales hipofisarias adecuadas con arquitecturas de tejido bien conservadas de ratones en desarrollo. Este procedimiento puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo de la hipófisis, como la histología de la hipófisis, la diferenciación celular, la proliferación y la apoptosis. La principal ventaja de esta técnica es que las hipófisis murinas en desarrollo pueden ser disecadas sin daños visibles y orientadas adecuadamente para lograr secciones coronales.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando descubrimos que, para desarrollar hipófisis murinas, era técnicamente difícil obtener secciones coronales adecuadas. Después de anestesiar y fijar a los ratones de acuerdo con el protocolo de texto, use unas tijeras para cortar el hueso del cráneo. A continuación, con fórceps, levante suavemente el cerebro posterior de la base del cráneo.

Luego, a la primera señal de la silla turca, deje de levantar pero sostenga el cerebro posterior y use unas tijeras finas para cortar el tallo pituitario y las fibras nerviosas conectadas a la base del cerebro. Continúe levantando y extrayendo todo el cerebro para exponer completamente la glándula pituitaria. La glándula pituitaria descansa sobre la superficie dorsal del hueso esfenoidal y está rodeada lateralmente por nervios trigéminos.

Luego, use tijeras para cortar toda la región selar, incluida la glándula pituitaria, los nervios trigéminos laterales y debajo del hueso esfenoides. Coloque el tejido en un plato de 35 mm que contenga 4% de PFA e incube a 4 grados centígrados durante 40 minutos a 3 horas, dependiendo de las edades. A continuación, utilice 10 mL de PBS para lavar el tejido fijo durante cinco cambios de 15 minutos cada uno.

Transfiera el tejido fijado a una placa de 35 mm que contenga 1 mL de PBS y, bajo un microscopio estereoscópico, disocie las glándulas pituitarias. Para las hipófisis P5 a P14, con pinzas finas y tijeras se eliminan las membranas conectivas entre los nervios y el hueso, y se aísla cuidadosamente la glándula pituitaria junto con los nervios trigéminos laterales en su conjunto, pero dejando la silla turca. En el caso de las hipófisis P21 y adultas, extirpe los nervios y las membranas conectivas que rodean la hipófisis y libere la glándula de los tejidos circundantes.

Después de la deshidratación, la limpieza de xileno y la infiltración de cera realizada de acuerdo con el protocolo de texto, en un sistema de consola de inclusión de tejidos, retire la muestra del casete y colóquela en un molde base medio lleno con cera de parafina fundida. Para las glándulas pituitarias P21 y adultas, use pinzas finas calentadas para colocar la glándula pituitaria con su eje corto perpendicular a la superficie inferior de un molde base. Para las pituitarias P0 a P4, oriente las muestras con sus huesos esfenoidales perpendiculares a la superficie inferior de un molde base.

Para las glándulas pituitarias P5 a P14, oriente las muestras con sus nervios trigéminos perpendiculares a la superficie inferior de un molde base. Después de colocar la glándula, use pinzas finas calentadas para sostener suavemente el tejido en la posición deseada hasta que la cera se vuelva semisólida en una placa de enfriamiento. Rellena el molde con cera de parafina fundida.

Deje que el bloque de parafina se enfríe hasta que la cera esté completamente solidificada. Enfríe el bloque de parafina a menos 20 grados centígrados durante 10 a 20 minutos, luego use un micrótomo para cortarlo en rodajas finas, ajustando la posición del bloque de parafina durante el corte. Realizar el inmunomarcaje según el protocolo de texto.

Como se muestra aquí, para diseccionar la glándula pituitaria del ratón neonatal, se diseccionó toda la región selar que contiene la glándula pituitaria, los nervios trigémino y el hueso esfenoidal debajo de la base del cráneo. La diminuta y delicada glándula pituitaria permaneció intacta durante el proceso. Para los ratones mayores de cinco días, se aislaron las glándulas pituitarias unidas a los nervios trigéminos laterales.

La estructura de crecimiento de la glándula pituitaria aislada del ratón P7 estaba bien conservada. Aquí, la glándula pituitaria del ratón P21 se aisló con éxito sin daños visibles mientras se eliminaba el tejido circundante. En esta figura, la tinción con H&E de secciones coronales correctamente orientadas demuestra una morfología bien conservada de adenohipófisis y neurohipófisis en las glándulas pituitarias P0, P7 y P21.

Por último, los portaobjetos procesados también fueron compatibles con el marcaje con inmunofluorescencia. A modo de ejemplo, la adenohipófisis y la neurohipófisis mostraron un inmunomarcaje específico de GH y GFAP, respectivamente. Una vez dominado, el proceso desde la disección hasta la inclusión se puede realizar en 7,5 horas en ratones adultos e incluso menos en ratones más jóvenes si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar diseccionar toda la región selar para evitar tocar la glándula pituitaria con cualquier instrumento quirúrgico. Siguiendo este procedimiento, también se puede aislar la hipófisis que no ha sido prefijada. En ese caso, se debe tener más precaución para evitar daños no deseados.

La glándula también debe ser diseccionada lo más rápido posible. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseccionar las glándulas pituitarias del ratón y preparar secciones coronales pituitarias en diferentes etapas de desarrollo.