Preparación de Synaptoneurosomes de ratón con una corteza discontinua de Percoll-sacarosa gradiente de densidad

El objetivo general de este procedimiento es preparar sinaptosomas con actividad traduccional a partir de la corteza cerebral de ratón, utilizando un gradiente de densidad discontinuo de sacarosa. Esto se logra primero recolectando y homogenizando las cortezas de ratón, y luego centrifugando el homogenizado. A continuación, se aplica el homogenizado centrifugado, o el sobrenadante, a los gradientes de sacarosa previamente preparados.

El paso final consiste en centrifugar y recoger la fracción de sinaptosomas. En última instancia, los análisis mediante inmunotransferencia y los experimentos de incorporación de metionina S³⁵ muestran que la fracción de sinaptosomas está enriquecida sinápticamente y es activa desde el punto de vista traduccional. Las principales ventajas de esta técnica frente a métodos existentes como la centrifugación y la filtración son que, primero, se evita el daño mecánico mediante el uso de gradientes de densidad, y segundo, que cada paso tiene baja toxicidad hacia las células y sus componentes.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con este protocolo porque el momento adecuado desempeña un papel clave. Una vez que se hayan recolectado los cortices, el procedimiento debe completarse rápidamente. Para comenzar el procedimiento, prepare las capas de gradiente al 3, 10, 15 y 23 % añadiendo las cantidades respectivas de SIP, tal como se describe en el manuscrito adjunto, al tampón GM y mezcle bien.

Vierta capas en gradiente pipeteando dos mililitros de cada una de las soluciones isosmóticas de percol del 23, 15, 10 y 3 % en tubos de centrífuga Beckman con tapa. Utilizando una pipeta P1000, la interfase entre las capas debe ser claramente distinguible sin mezcla de las mismas. Almacene los gradientes a cuatro grados Celsius durante al menos 20 minutos antes de usarlos.

Antes de comenzar este procedimiento, prepare las demás soluciones necesarias según se describe en el manuscrito adjunto. Sacrifique al ratón a la edad de P 13 a P 21 y prepárelo para la disección rociando la parte posterior del cuello y la cabeza con etanol al 70 %. Luego, use un par de tijeras afiladas para cortar la médula espinal en la base del cráneo.

A continuación, retire la piel de la parte superior del cráneo. Corte el cráneo lateralmente entre el hueso parietal y el hueso interparietal, o entre las regiones del cerebro y la corteza. Después de eso, corte el cráneo desde la base hasta la nariz a lo largo de la sutura sagital.

En este paso, retire cuidadosamente el hueso parietal blando tirando de cada hemisferio hacia el lado. A continuación, inserte la espátula en el cerebro por encima del cerebelo para extraer la corteza. Colóquela en tampón GM frío con hielo y repita nuevamente los procedimientos para recolectar más cortezas.

Ahora enjuague las cortezas en tampón GM frío con hielo. Luego transfiera dos cortezas a un homogenizador de vidrio que contenga cinco mililitros de tampón GM frío. Homogenice suavemente las cortezas con cinco a 10 pasadas del pistilo A, el pistilo suelto, seguido de cinco a 10 pasadas del pistilo B, el pistilo ajustado.

El número de pasadas varía según el homogenizador individual. Transfiera el homogenato a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifúguelo a 1000 veces.

Centrifugar por 10 minutos a cuatro grados Celsius en una centrífuga Allegra six KR para obtener un sedimento de restos celulares y núcleos. Aplicar en capas dos mililitros del sobrenadante para cada gradiente de sacarosa, utilizando un gradiente por cada corteza completa, y tapar los tubos. Luego, centrifugarlos en un rotor de ángulo fijo a 32.500 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius en una centrífuga Beckman J 2 21.

Una vez finalizado, utilizando los adaptadores adecuados, el gradiente debe presentar una banda SN intensa; retire con una pipeta y deseche la solución por encima de la banda SN. Con una pipeta de vidrio, retire la banda SN en la interfase del 15 al 23 %; por lo general, un gradiente proporciona aproximadamente entre 0,9 y 1,1 mililitros de sns. A continuación, transfiera a un tubo cónico y almacene en hielo.

Luego, ajuste la concentración de sal en el SNS añadiendo un décimo del volumen de tampón de estimulación 10 veces concentrado. Opcionalmente, añada cloruro de calcio 1000 veces concentrado para obtener una concentración final de 12 amolar. A continuación, añada el stock de TTX de un milimolar para alcanzar una concentración final de un micromolar con el fin de suprimir la excitación no específica.

El siguiente paso consiste en utilizar el SNS en la aplicación aguas abajo correspondiente, como estudios de traducción proteica. Para otras aplicaciones, el lisado de SN puede purificarse o concentrarse utilizando el kit de preparación de muestras Pierce SDS-PAGE. La concentración de proteína del SNS puede determinarse utilizando el kit de ensayo de proteína micro BCA.

Aquí se muestra un ejemplo de seis bandas o fracciones. Cuando la corteza de ratón se homogenizó y se separó mediante gradientes discontinuos de sacarosa Percoll, las SNS enriquecidas se encontraron en la banda cinco, en la interfase del 23 al 15%; esta banda se retiró y examinó mediante microscopía electrónica. Aquí se muestra un ejemplo de vesículas sinápticas intactas y la preservación de elementos pre-sinápticos y post-sinápticos en el inmunotransferencia.

Se observa un aumento en los marcadores sinápticos y una disminución en las impurezas en la banda SN de un gradiente discontinuo de sacarosa, lo que confirma que el incremento en la incorporación de metionina S 35 tras la adición de glutamato se debe a la síntesis de novo de proteínas. Se añadió 40 micromolar de anesamicina, un inhibidor de la síntesis de proteínas. Esta figura muestra la notable reducción en la incorporación de metionina S 35 en presencia de anso micina, con o sin glutamato, en comparación con los niveles basales.

Por lo tanto, los gradientes discontinuos de sacarosa peral producen rápidamente SNS altamente activos y relativamente puros, que pueden utilizarse para estudiar la traducción proteica. Esta figura muestra que la banda cinco del gradiente discontinuo de sacarosa por núcleo contiene los niveles más altos de síntesis de proteínas *de novo*. El SNS preparado haciendo pasar el homogenato cortical a través de una serie de filtros con tamaños de poro decrecientes y luego centrifugando sobre un gradiente discontinuo de sacarosa por núcleo, a modo de comparación, contiene más membranas rotas y menos SNS completos que el SNS preparado mediante el método del gradiente discontinuo de sacarosa peral. Se ha demostrado que el SNS preparado utilizando el método del gradiente discontinuo de sacarosa peral contiene mayor actividad de síntesis de proteínas *de novo* que el SNS preparado utilizando el método de filtración.

Se ha demostrado que los SNS preparados a partir de ratones más jóvenes tienen una mayor actividad traduccional que los de ratones mayores. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo aislar neurozonas sinápticas con actividad traduccional mediante la homogenización de cortezas de ratón, la centrifugación del homogenato en un rotor de cubeta oscilante, la centrifugación del sobrenadante sobre un gradiente de sacarosa Percoll en un rotor de ángulo fijo y, luego, la recolección de la banda de neurozona sináptica resultante.