Aislamiento y caracterización de micropartículas de neutrófilos derivado de estudios funcionales

El objetivo general de este protocolo es aislar y caracterizar micropartículas derivadas de neutrófilos para estudios funcionales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el papel de las vesículas de exocélulas, o micropartículas, en la comunicación célula-célula en diferentes procesos fisiológicos, como el cáncer, la inflamación y la cicatrización de heridas. Las principales ventajas de esta técnica son que es relativamente rápida, rentable y que permite la valoración de la composición fenotípica de micropartículas, o microvesículas, en activos funcionales.

Ariel Finkielsztein, becario postdoctoral en mi laboratorio, y Joseph Lee, estudiante en mi laboratorio, demostrarán el procedimiento. Para la separación en gradiente de densidad de células polimorfonucleares de médula ósea murina, o PMN, primero se colocan lentamente tres mililitros de solución de 1,077 gramos por mililitro recién preparada, a temperatura ambiente, sobre tres mililitros de solución de densidad de 1,119 gramos por mililitro recién preparada, a temperatura ambiente, en un tubo cónico de 15 mililitros por muestra de células de médula ósea. A continuación, superponga un mililitro de células de médula ósea recién aisladas en PBS helado en la capa de gradiente de densidad superior de cada tubo y separe las células mediante centrifugación en gradiente de densidad.

Al final de la separación, retire con cuidado las capas de células mononucleares en las interfaces entre el PBS y las capas de gradiente de densidad superior en cada tubo sin alterar las bandas de PMN. Con una pipeta de transferencia, recoja las capas de PMN en un nuevo tubo de 15 mililitros por muestra y eleve el volumen final de cada tubo a 15 mililitros con PBS filtrado de 0,1 micras de tamaño de vertido. Granular los PMN por centrifugación, seguida de una segunda centrifugación en dos mililitros de PBS fresco filtrado por tubo.

A continuación, vuelva a suspender los gránulos en un mililitro de PBS recién filtrado para contar. Después de contar, centrifugar las células nuevamente y volver a suspender el pellet en 100 microlitros de HBSS filtrado de 0,1 micras del tamaño de vertido, complementado con el estimulante de interés por cada 10 millones de células. Incubar durante 20 a 30 minutos a 37 grados centígrados.

Al final de la estimulación, recoja las células por centrifugación y transfiera los sobrenadantes libres de células a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 milímetros por muestra. Centrifugar los sobrenadantes para eliminar cualquier residuo celular y transferir los sobrenadantes aclarados a nuevos tubos de ultracentrífuga, luego ultracentrífuga los sobrenadantes y almacenar las micropartículas peletizadas en tubos de ultracentrífuga sellados con parafina a 80 grados Celsius hasta un análisis experimental adicional. Para administrar las micropartículas en el colon del ratón, primero coloque un ratón completamente anestesiado en posición prona y use pinzas de biopsia y un endoscopio equipado con una cámara de alta resolución para generar de tres a cinco heridas superficiales a lo largo del lado dorsal del colon.

Regrese el ratón a su jaula con monitoreo hasta que se recupere por completo. 24 horas después, use el endoscopio para obtener imágenes de las heridas infligidas bajo anestesia. A continuación, utilice un sistema de microinyección basado en colonoscopia para administrar un volumen experimental de micropartículas de PMN resuspendidas en 100 microlitros de HBSS directamente en cada sitio de la herida.

La heterogeneidad del tamaño de las micropartículas de PMN se puede evaluar comparando las micropartículas con perlas de citometría de flujo de tamaño conocido. Como se ha demostrado, la expresión de proteínas de interés por parte de las micropartículas también puede examinarse mediante citometría de flujo. En este experimento, se evaluó mediante inmunoblot la expresión de moléculas inflamatorias y antiinflamatorias clave por micropartículas derivadas de PMN estimuladas por activadores.

Los efectos de las micropartículas de PMN en la cicatrización de las células epiteliales se pueden monitorizar mediante la adquisición de imágenes de monocapas epiteliales heridas por arañazo en puntos de tiempo predeterminados in vitro, así como después de la herida con pinzas de biopsia in vivio. Una vez dominadas, las micropartículas derivadas de PMN se pueden aislar en cuatro horas, si la técnica se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que antes de la estimulación, el PMN debe mantenerse en hielo para evitar la activación prematura y la pérdida de micropartículas.

Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar técnicas de citometría de flujo, inmunotransferencia y reacción de proliferación en tiempo real para definir el contenido de micropartículas, en diversas condiciones de estimulación o a partir de diferentes células de origen. Esta técnica es útil para examinar el papel de la contribución de las micropartículas en la regulación de las respuestas inmunitarias, la función de barrera, la lesión y reparación de tejidos, así como en la progresión del cáncer. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar y etiquetar micropartículas murinas y usar las micropartículas en un activo funcional de cicatrización de heridas in vivo.

No olvide que trabajar con animales vivos puede ser peligroso, y que las precauciones sugieren que siempre se debe colocar el equipo de protección personal y completar las capacitaciones de seguridad adecuadas antes de realizar este procedimiento.