Estudiando la importación de la proteína en cloroplastos con protoplastos
10 de diciembre de 2018
Aquí se describe un protocolo para expresar proteínas en protoplastos mediante método de transformación mediada por PEG. El método proporciona fácil expresión de proteínas de interés y eficiente investigación de localización de la proteína y el proceso de importación para las varias condiciones experimentales en vivo.
Este misterio puede ayudar a responder algunas preguntas en el campo de la biología celular, como la entrada de proteínas en los cloroplastos. La principal ventaja de esta tecnología es que la entrada de proteínas en los cloroplastos se puede estudiar en condiciones en vivo. Demostrando el procedimiento serán Junho Lee y Hyangju Kang, dos post outs de mi laboratorio.
Para comenzar, cosecha los tejidos de las hojas intactas de plantas de dos semanas de edad de una a dos placas B5. Utilice un cuchillo quirúrgico para cosechar las hojas y colóquelas en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de solución enzimática. Coloque el tubo horizontalmente sobre una coctelera giratoria e incubar con agitación suave a 22 grados centígrados en la oscuridad durante ocho a 12 horas hasta que sólo los pecíolos y tallos permanezcan en la solución.
Después de completar la incubación, filtre la solución enzimática que contiene protoplastos liberados a través de una malla de 140 micrómetros de tamaño de poro en un plato fresco de Petri. A continuación, coloque cuidadosamente la solución encima de 15 mililitros de 21% de solución de sacarosa en un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar el tubo en un rotor de cucharón oscilante a 98 gs durante 10 minutos con la menor configuración de aceleración y desaceleración.
Después de eso, utilice la pipeta de patura para eliminar cuidadosamente los protoplastos de la capa superior que contiene la solución enzimática y de la interfaz entre la solución de enzimas y la solución de sacarosa. Transfiera esta solución a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 30 mililitros de solución W5 e invierta el tubo para mezclar. Centrifugar el tubo a 51 gs durante seis minutos.
Utilice una pipeta para desechar este sobrenadante cuidadosamente sin alterar los protoplastos en el pellet. Añadir 25 mililitros de solución W5 y volver a suspender suavemente los protoplastos. Para la estabilización, incubar en un refrigerador de cuatro grados Celsius durante un mínimo de una hora.
Después de cuatro grados de incubación Celsius, peletiza los protoplastos completamente centrifugándolos a 46 gs durante dos minutos. Retire cuidadosamente el sobrenadante por completo y agregue la solución MANG al pellet de protoplasto para lograr cinco veces diez a seis por mililitro. Utilice una pipeta para añadir 10 microgramos del ADN plasmático y 300 microlitros de solución de protoplasto a un tubo fresco de fondo redondo de 13 mililitros.
Mezclar girando suavemente los tubos a mano y luego añadir inmediatamente 300 microlitros de solución 40%PEG recién preparada. Mezclar completamente inclinando el tubo casi horizontalmente y girándolo suave varias veces a mano. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
A continuación, agregue un mililitro de solución W5 y mezcle completamente girando suavemente el tubo a mano como anteriormente. Incubar la muestra durante 10 minutos a temperatura ambiente. Repita dos veces más con la adición de primero 1,5 mililitros y luego dos mililitros de W5 y después de la adición final y la mezcla, incubar durante 30 minutos.
Centrifugar el tubo a 46 gs durante cuatro minutos y luego desechar el sobrenadante. Añadir dos mililitros de solución W5 al pellet y mezclar suavemente, pero completamente, de la misma manera que anteriormente. Incubar a 22 grados centígrados en una cámara oscura durante 18 horas.
Para analizar la importación de proteínas mediante microscopía de florescencia, utilice una pipeta con una punta recortada para colocar 10 microlitros de la solución de protoplasto en un portaobjetos. Utilice un resbalón de cubierta para cubrir cuidadosamente la solución para evitar dañar los protoplastos. Coloque la diapositiva en el escenario de un microscopio de fluorescencia con un filtro de admisión de excitación que esté configurado para observar la proteína fluorescente verde y la autofluorescencia de clorofila.
Utilice una cámara de dispositivo de par de carga enfriada para capturar imágenes y procesarlas utilizando un software de edición imagine para producir imágenes pseudocolor. Para la extracción total de proteínas y la inmunoblotting, retire un mililitro de la solución de protoplasto y mezcle el mililitro restante. Transfiera esta solución de protoplasto a un tubo centrífugo y centrífuga a 46 gs durante cuatro minutos.
Retire el sobrenadante después de completar la centrifugación y agregue 80 microlitros de tampón de desnaturalización. Vórtice vigorosamente durante cinco segundos. Agregue cinco tampón de muestra XDS, mezcle bien y hierva durante 10 minutos hasta la desnaturaltura.
Continúe con la página estándar de STS y el inmunoblotting con anticuerpos anti-GFP. RbcS y TGFT, una construcción de fusión que codifica los residuos de aminoácidos terminales de 79 extremos de RBCS que contienen el péptido de tránsito fusionado a la GFP, se utilizó para estudiar la importación de proteínas en cloroplastos mediante microscopía de florescencia e inmunoblotting. Cuando se examinan mediante microscopía de florescencia, las señales fluorescentes verdes de la proteína diana se fusionaron con las señales fluorescentes rojas de la autoflorescencia de clorofila que indica la importación de proteínas en cloroplastos.
Después de aislar la proteína total, se observan dos bandas de proteínas en el inmunoblot, mostrando que una proteína se importó correctamente en cloroplastos. La banda superior corresponde al precursor de longitud completa y la banda inferior a la forma procesada después de la importación en cloroplastos. La cantidad de la forma procesada de la proteína aumentó de una manera dependiente del tiempo, lo que sugiere que la proteína se importa en cloroplastos.
En este desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular exploraran el cansaning de proteínas o la recolección de hilos de membrana en Arabidopsis.
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Descripción general
Este artículo describe un método de transformación mediado por PEG para expresar proteínas en protoplastos, lo que permite el estudio de la localización de proteínas y los procesos de importación in vivo. El protocolo se demuestra mediante Junho Lee y Hyangju Kang, aportando información sobre la entrada de proteínas en los cloroplastos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Biología vegetal
- Expresión de proteínas
Antecedentes
- Comprender la localización de proteínas es fundamental en biología celular.
- Los cloroplastos desempeñan un papel importante en el metabolismo de las plantas.
- Estudiar los procesos de importación de proteínas puede mejorar nuestro conocimiento sobre las funciones celulares.
- La transformación mediada por PEG es una técnica ampliamente utilizada para protoplastos.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo para la expresión de proteínas en protoplastos.
- Investigar la localización de proteínas bajo condiciones in vivo.
- Facilitar la investigación sobre los procesos de importación de proteínas en cloroplastos.
Métodos Utilizados
- Recolección de tejidos foliares intactos de plantas de dos semanas de edad.
- Uso de un bisturí quirúrgico para preparar muestras de hojas.
- Incubación de tejidos foliares en una solución enzimática para el aislamiento de protoplastos.
- Aplicación de la transformación mediada por PEG para la expresión de proteínas.
Resultados principales
- Expresión exitosa de proteínas en protoplastos.
- Investigación eficiente de la localización de proteínas.
- Demuestra el protocolo mediante investigadores capacitados.
- Información sobre el proceso de importación de proteínas hacia los cloroplastos.
Conclusiones
- El método de transformación mediado por PEG es eficaz para la expresión de proteínas.
- Este enfoque permite el estudio de la dinámica de proteínas in vivo.
- Investigaciones futuras pueden ampliar las implicaciones de la importación de proteínas en los cloroplastos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Comprender los mecanismos de importación de proteínas hacia los cloroplastos proporciona conocimientos fundamentales para la validación de blancos en sistemas de bioproducción basados en plantas. Este ensayo basado en protoplastos permite reducir los riesgos mecanicistas en las vías de tráfico de proteínas codificadas en el núcleo, lo que respalda la confianza predictiva en la ingeniería de cloroplastos para la expresión de proteínas terapéuticas. El método ofrece un sistema relevante para enfermedades que permite evaluar la funcionalidad de las señales de direccionamiento y la eficiencia de importación en condiciones casi fisiológicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Analiza la funcionalidad de las señales de direccionamiento al cloroplasto y la cinética de importación de proteínas codificadas por el núcleo.
- Valor operativo: Permite la evaluación rápida de la localización proteica mediante microscopía de fluorescencia y análisis por inmunotransferencia.
- Valor predictivo: Facilita la comprobación de hipótesis sobre la eficacia del péptido de transito y la participación del aparato de importación.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera datos cuantitativos de inmunotransferencia que muestran la conversión de proteína precursora a proteína procesada a lo largo del tiempo.
- Valor operativo: Proporciona un protocolo reproducible de aislamiento y transfección de protoplastos mediante transformación mediada por PEG.
- Preparación del ensayo: Ofrece una capacidad de doble lectura (fluorescencia e inmunotransferencia) para la validación de la importación.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta el análisis de señales de direccionamiento en fase de descubrimiento con la evaluación preclínica de biológicos expresados en cloroplastos.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Aclara si la acumulación observada de proteínas se debe a una importación adecuada o a agregación citosólica.
- Confianza Predictiva: El aumento dependiente del tiempo en la banda de proteína procesada se correlaciona con la progresión funcional de la importación.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en flujos de trabajo de descubrimiento temprano en los que la validación del blanco precede a la identificación del compuesto inicial, particularmente para sistemas de expresión dirigidos al cloroplasto. Apoya campañas de cribado al proporcionar sistemas biológicos con capacidad de importación, listos para la evaluación de proteínas efectoras. Los análisis derivados del ensayo incluyen métricas de co-localización mediante fluorescencia y cuantificación basada en inmunotransferencia de la eficiencia de importación.
- Biología de Descubrimiento: Evalúa si las proteínas candidatas logran una localización subcelular adecuada mediante vías endógenas de importación.
- Selección: Proporciona preparaciones estandarizadas de protoplastos adecuadas para ensayos de localización de alto contenido.
- Análisis: Permite la cuantificación de la cinética de importación mediante las relaciones entre bandas precursoras y productos en inmunotransferencias.
- Investigación Traducional: Orienta el diseño de constructos para vectores de expresión en cloroplastos al validar la funcionalidad de los péptidos de transito.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar múltiples señales de direccionamiento en candidatos a proteínas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en las hipótesis de direccionamiento proteico mediante la visualización directa de la importación.
- Valor operativo: Proporciona un protocolo estandarizado y escalable de aislamiento de protoplastos con pasos definidos de centrifugación y resuspensión.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de continuar o descartar constructos de expresión en cloroplastos al confirmar la capacidad de importación.
- Impacto en el portafolio: Permite la priorización ajustada al riesgo de secuencias de direccionamiento basada en datos empíricos de importación.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el aislamiento de protoplastos vegetales, transfección mediada por PEG y microscopía de fluorescencia.
- Depende de equipos para la digestión enzimática de tejidos, centrifugación en gradiente de sacarosa y preparación de soluciones de PEG.
- Necesita la estandarización de la densidad de protoplastos (5×10⁶/mL) y la cantidad de ADN (10 µg) para lograr una expresión reproducible.
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse a especies distintas de Arabidopsis o a sistemas alternativos de transformación de cloroplastos.
- Las limitaciones prácticas incluyen el período de viabilidad de los protoplastos tras el aislamiento y su sensibilidad al estrés osmótico durante la incubación con PEG.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Title
0:33
Protoplast Isolation
2:19
Protoplast Transformation using Polyethylene Glycol
3:53
Analysis of the Protein Import into Chloroplasts
5:10
Results: Fluorescence Microscopy and Immunoblotting to Analyze the Import of Proteins into Chloroplasts
6:07
Conclusion
