Microscopía de seguimiento de una sola molécula - Una herramienta para determinar los estados difusos de las moléculas citosólicas
5 de septiembre de 2019
La microscopía de localización de una sola molécula 3D se utiliza para sondear las posiciones espaciales y las trayectorias de movimiento de las proteínas etiquetadas fluorescentes mente en células bacterianas vivas. El protocolo experimental y de análisis de datos descrito en este documento determina los comportamientos difusivos prevalentes de las proteínas citosólicas basadas en trayectorias agrupadas de una sola molécula.
El seguimiento 3D de una sola molécula puede determinar las localizaciones subcelulares y los comportamientos de movimiento de las proteínas individuales. Observar el movimiento de una proteína en una célula viva proporciona información importante sobre su interacción con socios de unión en su entorno nativo. El método presentado aquí proporciona un marco general para analizar datos de seguimiento de una sola molécula para resolver los estados difusores de moléculas biológicas.
Se puede aplicar a trayectorias 2D y 3D que se limitan a volúmenes de celdas con forma arbitraria. Después de depositar un cordón fluorescente en una almohadilla de agarosa pre-preparada como se describe en el protocolo de texto que lo acompaña, colóquelo en un resbalón de la cubierta del microscopio y asegure el resbalón de la cubierta al soporte de la muestra del microscopio. El portacuchillas se monta en un microscopio de fluorescencia invertido.
A continuación, inicializar la interfaz gráfica de usuario del microscopio;aquí, el software escrito a medida en MATLAB se utiliza para el control de instrumentos. Inicializar el software de cámara HCImage Live. En la pestaña Captura de la sección Control de cámara, establezca el tiempo de exposición en 0,03 segundos y, a continuación, haga clic en Live (En directo) para iniciar una transmisión en directo de la cámara.
Haga clic en el botón Abrir láser apropiado en la interfaz GUI para desbloquear el láser y excitar las perlas fluorescentes en la almohadilla de agarosa. Vea la emisión de fluorescencia en la cámara utilizando el modo de transmisión en vivo. Ajuste las posiciones X e Y de la etapa del microscopio haciendo clic en las flechas Posición XY debajo de la sección Etapa de microposición de la interfaz de usuario para colocar al menos un cordón fluorescente en el centro del campo de visión.
Si es necesario, modifique el tamaño del paso haciendo clic en el cuadro desplegable debajo de las flechas. A continuación, ajuste la posición Z de la etapa del microscopio haciendo clic en las flechas de posición Z debajo de la sección Etapa de nanoposición. Establezca la orientación de la función de dispersión de punto de doble hélice del cordón fluorescente para que sea vertical.
Esta orientación vertical se define como el punto de partida en la calibración Z. Escanee 30 pasos por encima y por debajo de la posición Z inicial en incrementos de 50 nanómetros. Registre 10 fotogramas en cada paso utilizando un tiempo de exposición de 0,03 segundos.
Para iniciar la adquisición automatizada de datos, haga clic en Ir en Z-Calibración. Centrifugar un mililitro de cultivo de Yersinia enterocolitica con choque térmico a 5.000 veces la gravedad durante tres minutos a temperatura ambiente y luego retire el cultivo y deseche el sobrenadante. Lave el pellet tres veces con un mililitro de medios M2G.
Después del enjuague final, resuspender las bacterias peletizadoras en 250 microlitros de medios M2G. A continuación, agregue perlas fluorescentes para utilizar como marcadores fiduciarios. La solución de perlas fluorescentes debe añadirse para que solo haya de una a dos cuentas por campo de visión cuando se vea en el microscopio.
Mezclar suavemente la suspensión por vórtices para separar las células agregadas y la placa 1,5 microlitros de la suspensión en una almohadilla de agarosa de 1,5 a 2% hecha con M2G, luego invierta la almohadilla y colóquela en un resbalón de cubierta de microscopio limpiado con ozono. Agregue una gota de aceite de inmersión en el objetivo del microscopio y coloque el soporte de muestra en la etapa del microscopio y fíjelo en su lugar. Inicialice la interfaz gráfica de usuario para controlar la cámara, la etapa de muestreo y los láseres de excitación del microscopio y, a continuación, inicialice el software de la cámara.
En la pestaña Captura de la sección Control de cámara, establezca el tiempo de exposición en 0,025 segundos y, a continuación, haga clic en Live (Live) para iniciar una transmisión en directo de la cámara. Ajuste las posiciones X e Y de la etapa del microscopio haciendo clic en las flechas posición XY debajo de la sección Etapa de microposición para escanear alrededor de la muestra y encontrar un campo de visión con una población adecuadamente densa de células bacterianas. Para maximizar el rendimiento de los datos, la densidad de celdas en el resbalón de cubierta debe ser lo más alta posible sin que las celdas se superpongan o se toquen entre sí.
El campo de visión también debe incluir al menos un cordón fluorescente como marcador fiduciario para que el desplazamiento de etapa se pueda medir mientras se adquieren los datos. A continuación, ajuste la posición Z de la etapa del microscopio haciendo clic en las flechas de posición Z debajo de la sección Etapa de nanoposición para que los lóbulos de doble función de dispersión de punto de doble hélice de las cuentas fluorescentes sean verticales. A continuación, vaya a Secuencia y seleccione Configuración de escaneado.
Cambie el número de recuentos de fotogramas a 20.000. A continuación, elija una carpeta de destino de guardado haciendo clic en el botón etiquetado con tres puntos. Por último, haga clic en Iniciar para recopilar hasta 20.000 fotogramas de cámara con un tiempo de exposición corto de 0,025 segundos.
Cuando haya terminado, bloquee la iluminación láser haciendo clic en el botón Cerrar láser apropiado en la interfaz gráfica de usuario. A continuación, recopile 200 fotogramas de imágenes oscuras utilizando el mismo tiempo de exposición. Marque la casilla junto a Thorlabs LED y luego haga clic Toggle Mirror Up.This encenderá la luz LED por encima de la muestra y cambiará el microscopio de la vía de fluorescencia a la vía de contraste de fase.
Inicialice el software de adquisición de datos en la vía de contraste de fase y pulse el botón Start/Stop Live Display para ver una transmisión en directo desde la cámara. A continuación, haga clic en Capturar e ir para guardar la imagen para recopilar una imagen de contraste de fase de las celdas en el campo de visión actual. Ajuste el cordón fluorescente para su uso como marcador fiduciario.
Busque y ajuste todas las localizaciones y todos los marcos de la cámara utilizando los umbrales de plantilla como se describe en el protocolo de texto. En la sección Localizar DHPSF SM de la GUI Easy-DHPSF, haga clic en Ejecutar para ajustarse a las señales de una sola molécula y, a continuación, haga clic en Aceptar en las siguientes ventanas emergentes para mantener la configuración predeterminada. El software encontrará señales de fluorescencia de una sola molécula que se asemejan a la función de dispersión de punto de doble hélice y luego intentan encajarlas utilizando un modelo de doble gaussiano.
A medida que se ejecuta el script, el usuario verá una visualización de los datos de imagen sin procesar, así como una imagen reconstruida de las señales de una sola molécula ajustadas con éxito. Usando software escrito a medida en MATLAB, comience seleccionando manualmente cinco pares de puntos de control en la ventana emergente estimando y haciendo clic aproximadamente en los polos de celda de las mismas cinco celdas tanto en los datos de localización de una sola molécula como en los contornos de celda. Elimine las celdas que contienen menos de 10 localizaciones y elimine las celdas que se colocan parcialmente fuera del campo de visión y, a continuación, elimine las celdas no deseadas adicionales en la ventana emergente haciendo clic dentro del contorno de su celda.
Por último, asigne localizaciones que residan dentro del límite del contorno de una celda a esa celda. Deseche las localizaciones que no se encuentren dentro de ningún esquema de celda. Un factor crítico para la aplicación exitosa de este protocolo es asegurar que las señales de una sola molécula estén bien separadas entre sí.
Si hay más de una molécula fluorescente en una célula al mismo tiempo, entonces la localización se puede asignar incorrectamente a la trayectoria de otra molécula. Este protocolo funciona para eliminar el problema de vinculación descartando cualquier trayectoria para la que dos o más localizaciones estén presentes simultáneamente en la misma celda. Por lo tanto, si las señales de una sola molécula son demasiado densas, una gran cantidad de estos datos se descartan automáticamente durante el procesamiento.
Dependiendo de los niveles de expresión de las proteínas de fusión con etiqueta fluorescente, se pueden generar aproximadamente 200 a 3.000 localizaciones por célula. Estas localizaciones pueden producir entre 10 y 150 trayectorias. Un gran número de trayectorias son necesarias para producir distribuciones bien muestreadas.
Aquí se muestra el histograma de coeficientes de difusión aparentes para cerca de 80.000 trayectorias de una sola molécula de la proteína de secreción Yersinia enterocolitica Tipo 3 YscQ etiquetada con proteína fluorescente eYFP. YscQ se une a los inyectables incrustados en membrana dando como resultado una fracción de moléculas, alrededor del 24% que no se difunden, como lo indica la distribución mostrada en negro. Las moléculas YscQ restantes se difunden libremente en el citosol.
Durante el método descrito aquí, se determina que las moléculas YscQ no enlazadas existen en al menos tres estados difusores distintos. Esta conclusión se llegó ajustando la distribución de coeficientes de difusión aparentes con una biblioteca de distribuciones simuladas con coeficientes de difusión conocidos. Al intentar resolver múltiples estados difusores, se deben recolectar varios miles de trayectorias de una sola molécula para garantizar que las distribuciones del coeficiente de difusión aparente se muestreen muy bien.
El seguimiento de una sola molécula se puede realizar en células de tipo salvaje o en mutantes de eliminación genética para determinar si los estados difusos específicos se manifiestan solo cuando hay un socio de unión molecular. Al resolver los estados difusores de las proteínas citosólicas y los complejos proteicos utilizando el seguimiento 3D de una sola molécula, los investigadores pueden determinar dónde, cuándo y cómo se forman los complejos de proteínas oligoméricas en las células vivas. Trabajar con fuentes láser de alta potencia y patógenos humanos vivos puede ser extremadamente peligroso.
Siempre se deben seguir los protocolos adecuados de seguridad láser y bioseguridad.
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Descripción general
Este estudio utiliza el seguimiento tridimensional de moléculas individuales para investigar las posiciones espaciales y las trayectorias de movimiento de proteínas marcadas con fluorescencia en células bacterianas vivas. El método proporciona información sobre las interacciones proteicas y los comportamientos difusivos en sus entornos naturales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- biofísica
- Biología celular
Antecedentes
- Comprender el movimiento de las proteínas es fundamental para elucidar los procesos celulares.
- El seguimiento de moléculas individuales permite observar la dinámica de proteínas individuales.
- El método puede analizar trayectorias tanto en 2D como en 3D.
- Es aplicable a diversos entornos celulares.
Objetivo del estudio
- Determinar las localizaciones subcelulares de proteínas individuales.
- Analizar los comportamientos de movimiento de proteínas en células vivas.
- Proporcionar un marco para resolver los estados difusivos de moléculas biológicas.
Métodos Utilizados
- Microscopía de localización de moléculas individuales en 3D.
- Etiquetado fluorescente de proteínas.
- Análisis de datos de trayectorias individuales de moléculas agrupadas.
- Uso de microscopía de fluorescencia invertida para la observación.
Resultados principales
- Seguimiento exitoso del movimiento de proteínas en células bacterianas vivas.
- Identificación de comportamientos difusivos prevalentes de proteínas citosólicas.
- Conocimientos sobre las interacciones de proteínas con sus socios de unión.
- Marco aplicable a diversas formas y tamaños de células.
Conclusiones
- El método mejora la comprensión de la dinámica de las proteínas en las células.
- Proporciona una herramienta valiosa para estudiar las interacciones moleculares.
- Las aplicaciones futuras podrían extenderse a otros sistemas biológicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La microscopía de seguimiento de moléculas individuales permite la cuantificación precisa de los estados de difusión de proteínas en células vivas, proporcionando información esencial sobre la oligomerización y la formación de complejos. Esta capacidad apoya la validación de objetivos al resolver los estados funcionales de las proteínas en entornos fisiológicamente relevantes, reduciendo la ambigüedad mecanicista en las etapas iniciales del descubrimiento. El método mejora la confianza predictiva en la identificación de fármacos líderes al vincular el comportamiento molecular con resultados funcionales en contextos celulares nativos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas mediante la resolución de estados difusivos distintos de las proteínas tras la formación de complejos homo- y hetero-oligoméricos.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de dianas en células vivas mediante la cuantificación de la formación de complejos moleculares a través del análisis del coeficiente de difusión.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al determinar la abundancia relativa de los estados difusivos, lo que aporta información sobre la confianza en la diana y su desescalada de riesgos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Preparación del ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante la generación de trayectorias bien muestreadas a partir de miles de localizaciones individuales de moléculas por célula.
- Resultado cuantitativo: Proporciona distribuciones de coeficientes de difusión y fracciones poblacionales como lecturas medibles para la selección de compuestos.
- Reproducibilidad: Incorpora en el análisis las limitaciones de precisión y exactitud experimentales mediante simulaciones estocásticas, asegurando una evaluación confiable de los compuestos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Se aplica a proteínas citosólicas en patógenos bacterianos, ofreciendo un sistema relevante para la enfermedad para estudiar la oligomerización en modelos de infección.
- Continuidad traslacional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al vincular los estados difusivos con la formación de complejos funcionales en entornos naturales.
- Avance ajustado al riesgo: Informa las decisiones de continuar o descartar al cuantificar cómo los socios de unión alteran la difusión de las proteínas, apoyando la desestimación mecanicista de riesgos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la prueba de hipótesis hasta la identificación de compuestos activos, permitiendo la evaluación cuantitativa del comportamiento de proteínas en células vivas antes del cribado de compuestos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al resolver los estados difusivos prevalentes de moléculas marcadas con fluorescencia en células vivas.
- Selección: Proporciona trayectorias listas para ensayos y reproducibles, con mediciones cuantitativas de la difusión esenciales para la evaluación fiable de compuestos.
- Análisis: Ofrece resultados estadísticos mediante el ajuste de distribuciones experimentales a bibliotecas simuladas, permitiendo la comparación de condiciones y estados.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al vincular los estados difusivos con la oligomerización en entornos citosólicos de modelos patogénicos.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma reutilizable para explorar interacciones proteicas en múltiples dianas y tipos celulares.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva mediante la resolución de estados difusivos y la cuantificación de la formación de complejos moleculares en células vivas.
- Valor operativo: Normalización y escalabilidad mediante la adquisición y análisis automatizados de hasta 20.000 fotogramas por experimento.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción al reducir riesgos biológicos en fases avanzadas mediante la detección temprana de cambios en la difusión impulsados por oligomerización.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo basada en poblaciones cuantitativas de estados de difusión y umbrales de formación de complejos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía de molécula individual, análisis basado en MATLAB y marcos de simulación estocástica.
- Necesita un microscopio de fluorescencia invertido con excitación láser, cámara de alta velocidad y estabilización de la platina para el seguimiento en 3D.
- Exige una estandarización entre equipos en la preparación de muestras, el uso de marcadores fiduciales y el filtrado de trayectorias para evitar errores de vinculación.
- Requiere adaptar los modelos de geometría celular y los parámetros de simulación a distintos organismos o sistemas de tejidos.
- Limitación práctica: una alta densidad de localizaciones conduce al descarte de datos durante el procesamiento, lo que exige niveles controlados de expresión.
