Preparación rápida de la rejilla para la crio-microscopía electrónica resuelta en el tiempo
6 de noviembre de 2021
Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para el uso de un dispositivo de fabricación de cuadrícula rápida tanto para la fabricación rápida de rejillas como para la mezcla y congelación rápidas para realizar experimentos resueltos en el tiempo.
Hola, y bienvenidos a este video de JoVE. Queremos presentarle la configuración que tenemos aquí para la creación rápida de cuadrículas, un estudio resuelto en el tiempo que estamos desarrollando en Leeds. Tenga en cuenta que este no es un sistema estándar, pero esperamos que al darle una cuenta detallada de todas las cosas y los parámetros que hacemos, pueda desarrollar sistemas similares en sus propios laboratorios.
Una descripción detallada del dispositivo se da en el protocolo de Richmond. Aquí, vamos a dar una guía paso a paso para una preparación rápida de la cuadrícula y em resuelto en el tiempo. En nuestra experiencia, la concentración de proteínas debe ser de dos miligramos por mililitro o más. El protocolo requiere un volumen mínimo de unos 50 microlitros.
Encienda el dispositivo. Luego encienda la PC de control e inicie el software de control. Inicialice todas las bombas de jeringa presionando el botón de inicialización en cada bomba de jeringa.
Encienda la fuente de alimentación del potenciómetro, configálelo a nueve voltios e inicie el software de control del osciloscopio. Se necesita gas nitrógeno presurizado para generar el aerosol. Abra el cilindro de nitrógeno y ajuste la presión a 2 bar.
Asegúrese de que todas las válvulas de la bomba de jeringa estén en posición de carga. Para hacer esto, cambie todas las válvulas para dispensar en el software de control y luego vuelva a cargar. Ajuste todas las jeringas a cero.
Cualquier burbuja de aire presente en el sistema debe eliminarse en esta etapa. Para hacer esto, las jeringas pueden tener que ser desenroscados, las burbujas retiradas manualmente, y las jeringas montadas de nuevo cuando no contienen más burbujas. El sistema de manejo de líquidos generalmente se almacena en agua.
Antes de cargar la muestra, el sistema se equilibra con el búfer. Esto se hace lavando el tubo con un exceso de tampón. Coloque un tubo que contenga al menos 200 microlitros de tampón sobre la jeringa uno.
La parte superior del tubo debe perforarse para unirlo. Aspire una cantidad adecuada de tampón, entre 50 y cien microlitros con jeringa uno utilizando el software de control. Cambie la válvula uno para dispensar.
Dispense todo el líquido en la jeringa uno. Devuelva la válvula uno a la posición de carga y presione el botón de inicialización en la jeringa uno para preparar el sistema para el siguiente ciclo de lavado. Estos pasos generalmente se repiten tres veces para garantizar un lavado completo de la tubería.
A continuación, se coloca la boquilla de pulverización. Coloque una rejilla EM en el brazo de hundimiento. Coloque la rejilla frente a la boquilla de pulverización.
Dispense el búfer utilizando el software de control. Si la boquilla y la rejilla están alineadas, el líquido debe acumularse después de la pulverización durante un período prolongado de tiempo. Si es necesario, ajuste la posición de la boquilla y luego verifique nuevamente dónde se acumula el líquido en la rejilla.
A continuación, ajuste la posición de la copa de etano. La punta de las pinzas debe llegar aproximadamente al centro de la copa de etano. Realice una ejecución de prueba para asegurarse de que todas las configuraciones son correctas.
Cierre la cámara de humedad. Asegúrese de que el camino del émbolo esté despejado. Aspire el volumen de tampón requerido para una sola carrera en jeringa uno.
Cambie la válvula uno para dispensar. Inicie la ejecución presionando run'in en el software de control. Compruebe que la bomba de jeringa uno está en movimiento, dos segundos en este caso, y la rejilla se hunde después de un retraso apropiado, 1,5 segundos aquí.
Cuando termine la carrera, ajuste la presión sobre el brazo del émbolo al valor deseado. Presione OK'in en el software de control para liberar la presión del brazo que se hunde. Ahora la taza de etano está fría y llena de etano líquido.
Descarga con brillo las rejillas antes de usarlas. Una descarga de resplandor típica es de 90 segundos a 10 miliamperios en aire de 0,1 milibares. El tubo se equilibra con la muestra.
Si el volumen de muestra disponible es bajo, el tubo puede equilibrarse con un solo volumen muerto. Muestra aspirada. Por lo general, el volumen muerto es de alrededor de 30 microlitros.
Cambie la válvula uno para dispensar. Dispensar la muestra a través de tubos y boquillas. A continuación, aspire la cantidad de muestra requerida para una sola ejecución.
Cambie la válvula uno para dispensar. Compruebe que la humedad relativa ha alcanzado el valor deseado. Por lo general, preparamos cuadrículas al 60% o más.
Esto puede tardar unos minutos. Coloque las pinzas que sostienen una rejilla descargada por resplandor en el brazo de inmersión. Coloque la corredera del potenciómetro en la posición de inicio, lista para la medición de velocidad.
Configure el disparador para la medición de velocidad en el software del osciloscopio. Coloque la taza de etano líquido y cerca de la cámara de humedad. Asegúrese de que el camino del émbolo esté despejado.
Inicie la ejecución en el software de control. Cuando termine la ejecución, presione OK'in en el software de control para liberar la presión del brazo que se hunde. Abra la cámara de humedad, afloje la conexión entre el brazo de inmersión y las pinzas.
Suba por el brazo de inmersión mientras mantiene la rejilla en etano líquido. Luego transfiera las rejillas al nitrógeno líquido y al almacenamiento. Guarde la medición del osciloscopio.
Restablezca manualmente la posición del control deslizante y el émbolo del potenciómetro. Repita el protocolo para preparar cuadrículas de réplica. Los experimentos resueltos en el tiempo se realizan de manera similar.
Se necesitan concentraciones de stock más altas para los experimentos resueltos en el tiempo debido a la dilución en la etapa de mezcla. Para un experimento resuelto en el tiempo, use las tres jeringas. El tubo está conectado a las bombas de la jeringa y a la boquilla de pulverización.
La boquilla de pulverización microfluídica utilizada aquí también contiene un elemento de mezcla. Tenga en cuenta que los tubos más largos darán un volumen muerto más grande y los pasos de equilibrio de lavado requieren más tampón y muestra. Equilibre todas las jeringas con tampón y muestree por separado.
Por lo general, la jeringa uno se usa para la muestra A' y las jeringas dos y tres se usan para la muestra B'Después de equilibrar el tubo, cargue la muestra A en la jeringa uno y la muestra B en las jeringas dos y tres. Luego, cambie las válvulas de una a tres para dispensar. Inicie la ejecución en el software de control.
Tenga en cuenta que se necesita un script de ejecución diferente para un experimento resuelto en el tiempo. Se pueden lograr diferentes retrasos de tiempo de dos maneras. Al ajustar la velocidad del émbolo, se puede cambiar el retraso de tiempo desde la mezcla hasta la congelación.
Una velocidad de inmersión más rápida conducirá a un retraso de tiempo más corto. Alternativamente, la distancia de etano de pulverización se cambia ajustando la posición vertical de la boquilla de pulverización. Aumentar la distancia resultará en un retraso de tiempo más largo.
En el microscopio electrónico a bajo aumento, una cuadrícula típica se ve así. Las áreas de hielo delgado, como se indica, son adecuadas para la adquisición de datos. A aumentos más altos, las partículas deben ser claramente visibles.
Con una muestra de prueba como la apoferritina, un conjunto de datos relativamente pequeño de una sola cuadrícula es suficiente para una reconstrucción a una resolución de tres a cuatro angstrom. Para los experimentos resueltos en el tiempo, recopilamos conjuntos de datos de diferentes puntos de tiempo o cuadrículas. Es útil combinar los datos para la clasificación 3D y luego rastrear las partículas hasta sus puntos de tiempo.
De esta manera, los datos pueden proporcionar información estructural e información sobre la cinética de reacción. En conclusión, esperamos que os haya gustado el vídeo. Esperamos que con las descripciones detalladas en el documento de JoVE junto con el video, pueda realizar sus propios experimentos a través de la creación rápida de cuadrículas, que se ha demostrado que alivia algunos de los problemas de mutación o ayuda con las interacciones en la interfaz aire-agua, todo lo que necesita para realizar sus propios estudios resueltos en el tiempo para tratar de atrapar algunos de esos estados de no equilibrio.
Entonces, feliz fabricación de cuadrículas.
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Visión general
Este artículo presenta un protocolo detallado para la preparación rápida de rejillas en microscopía electrónica criogénica (crio-EM), centrándose tanto en la elaboración estándar rápida de rejillas como en experimentos con resolución temporal. El método descrito utiliza un dispositivo personalizado fabricado en el laboratorio que permite la preparación de rejillas en milisegundos, facilitando la captura de estados intermedios de corta duración en reacciones proteicas. El protocolo está diseñado para ser accesible para investigadores que deseen desarrollar sistemas similares o realizar estudios de crio-EM con resolución temporal.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microscopía electrónica criogénica (cryo-EM)
- Biología estructural
- Tecnología de preparación de muestras
Antecedentes
- La microscopía electrónica criogénica (cryo-EM) está avanzando rápidamente gracias a mejoras en el hardware y en los algoritmos de procesamiento de datos.
- Los métodos tradicionales de preparación de muestras, como el blotting, están siendo reemplazados por técnicas más rápidas como la dispensación piezoeléctrica, la impresión con aguja y la pulverización directa.
- La preparación rápida de rejillas es esencial para la cryo-EM resuelta en el tiempo, lo que permite el estudio de estados moleculares transitorios.
- Los desafíos incluyen el control del grosor del hielo y la optimización del uso de la muestra.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo paso a paso para la preparación rápida y resuelta temporalmente de rejillas de microscopía crioelectrónica (crio-EM) utilizando un dispositivo personalizado.
- Permitir a los investigadores replicar o adaptar el método para sus propios laboratorios.
- Facilitar el estudio de reacciones bioquímicas rápidas mediante el atrapamiento de estados intermedios.
Métodos Utilizados
- Preparación e inicialización de un dispositivo personalizado para la elaboración rápida de rejillas, con bombas de jeringa y una boquilla de pulverización microfluídica.
- Equilibrado del sistema con tampón y eliminación de burbujas de aire de los tubos.
- Descarga por efecto glow en rejillas de microscopía electrónica antes de la aplicación de la muestra.
- Alineación precisa de la boquilla de pulverización, la rejilla y el recipiente de etano para una congelación óptima.
- Control automatizado de la dispensación de la muestra, pulverización e inmersión en etano líquido.
- Experimentos resueltos temporalmente utilizando múltiples jeringas para la mezcla rápida de reactivos antes de la congelación.
- Ajuste de los retrasos temporales mediante la velocidad del émbolo y la posición de la boquilla.
Resultados principales
- La preparación de rejillas puede lograrse con tan solo 50 µL de muestra a concentraciones ≥2 mg/mL para cuatro rejillas.
- El retraso entre la aplicación de la muestra y la congelación puede ser tan bajo como 10 ms.
- Los experimentos resueltos en el tiempo permiten la captura de intermediarios de reacción mediante la variación de los retrasos entre mezclado y congelación.
- Las rejillas resultantes son adecuadas para la recopilación de datos de alta resolución, con muestras de prueba que producen reconstrucciones a una resolución de 3–4 Å.
Conclusiones
- El protocolo permite una preparación rápida y reproducible de rejillas para microscopía electrónica criogénica, compatible tanto con estudios estándar como con estudios resueltos en el tiempo.
- Los investigadores pueden adaptar el montaje descrito para desarrollar sus propios dispositivos de fabricación rápida de rejillas.
- Este enfoque abre nuevas oportunidades para estudiar procesos biológicos dinámicos con alta resolución temporal y espacial.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Preparación rápida de rejillas para criomicroscopía electrónica permite capturar estados moleculares transitorios, impactando directamente el descubrimiento temprano y la reducción de riesgos mecanicistas en I+D biofarmacéutica&D. Al reducir el tiempo desde la mezcla de la muestra hasta la congelación a tan solo 10 ms, este enfoque permite el análisis estructural de alta resolución de intermediarios de corta duración, aportando información valiosa para la validación de dianas y la identificación de compuestos iniciales. La reproducibilidad y adaptabilidad del protocolo lo posicionan como una capacidad escalable para los flujos de descubrimiento empresariales.
Aplicaciones Estratégicas en Biotecnología Farmacéutica R&D
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite el estudio de conformaciones proteicas dinámicas e intermediarios de reacción.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al revelar estados estructurales transitorios relevantes para la función.
- Facilita la confianza predictiva en la interacción con el objetivo y la modulación de la vía.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Prepara rejillas de microscopía crioelectrónica validadas adecuadas para cribado estructural de alto rendimiento.
- Proporciona resultados cuantitativos reproducibles para análisis comparativo entre diferentes condiciones.
- Permite la evaluación rápida de cambios estructurales inducidos por compuestos en proteínas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relaciona instantáneas estructurales con mecanismos relevantes para la enfermedad, garantizando continuidad traslacional.
- Facilita el avance ajustado al riesgo al proporcionar datos de alta resolución sobre estados funcionales.
- Permite la integración de conocimientos estructurales en la selección de modelos preclínicos y en estrategias de biomarcadores.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo rápido de preparación de rejillas es adecuado desde el descubrimiento inicial hasta la identificación de compuestos activos, apoyando tanto flujos de trabajo basados en hipótesis como aquellos basados en cribado en biología estructural.
- Biología del Descubrimiento: Acelera la comprobación de hipótesis al capturar estados fuera del equilibrio para una mayor claridad mecanicista.
- Selección: Proporciona cuadrículas estandarizadas y reproducibles para el análisis posterior por criomicroscopía electrónica y la evaluación de compuestos.
- Análisis: Permite la medición cuantitativa de cambios estructurales y cinética de reacción a lo largo de diferentes puntos temporales.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al vincular intermediarios estructurales con resultados funcionales.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un protocolo modular y adaptable para diversos sistemas proteicos y diseños experimentales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas.
- Valor operativo: Estandariza la preparación de rejillas, mejorando la reproducibilidad y escalabilidad entre equipos.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones más acertadas de avance/no avance al proporcionar datos estructurales con alta resolución y resolución temporal.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización y el avance ajustado al riesgo de dianas validadas estructuralmente.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en instrumentación de microscopía crioelectrónica y manejo de muestras.
- Necesita acceso a dispensación microfluídica, controles precisos de temporización e infraestructura criogénica.
- Exige estandarización entre equipos para garantizar la calidad reproducible de las rejillas y la comparabilidad de los datos.
- Adaptable a diversos sistemas proteicos, aunque puede requerir optimización en cuanto a concentración de la muestra y grosor del hielo.
- Un mayor grosor del hielo a velocidades más altas puede limitar la calidad de los datos en algunas aplicaciones.
