Sistema de pseudoislotes humanos para la evaluación sincrónica de la dinámica de biosensores fluorescentes y perfiles de secreción de hormonas
3 de noviembre de 2023
Este protocolo describe un método para la adquisición sincrónica y el co-registro de eventos de señalización intracelular y la secreción de insulina y glucagón por pseudoislotes humanos primarios utilizando la administración adenoviral de un biosensor de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), un detector de diferencia de cAMP in situ (cADDis) y un sistema de microperifusión.
Nuestro laboratorio está trabajando para comprender, prevenir y revertir la disfunción de las células beta y otras anomalías de los párpados en la diabetes tipo uno y tipo dos. Nuestros estudios se centran en la patogénesis de la diabetes humana mediante la integración de estudios de la biología del páncreas y los párpados humanos y la salud y la enfermedad. Los ojales humanos son estructuras esféricas en 3D, y el acceso a las células a lo largo de todo el ojal presenta algunos desafíos experimentales.
Por ejemplo, al tratar de introducir biosensores para comprender la señalización de las células de los ojales, nuestro protocolo de pseudopárpados supera este desafío realizando manipulaciones genéticas en el estado de una sola célula y agregando estas células de los ojales humanos transducidos en pseudopárpados para estudios posteriores. Nuestro sistema de pseudopárpados nos permite expresar biosensores en todo el ojal, en lugar de solo en la superficie del párpado. En combinación con nuestras imágenes de células vivas y el sistema de microperfusión, podemos medir y co-registrar procesos intracelulares dinámicos con la secreción de hormonas aguas abajo.
Este protocolo podría aplicarse para responder a una variedad de preguntas científicas importantes. Por ejemplo, las estrategias de silenciamiento génico podrían combinarse con este enfoque para comprender el impacto de un gen de interés en la función de los párpados y las vías de señalización asociadas, ya sea globalmente o de manera autoespecífica.
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Descripción general
Este estudio aborda la disfunción de las células beta y las anomalías de los islotes en la diabetes, utilizando un sistema de modelo de pseudoislotes para la adquisición sincrónica de señales celulares y secreción hormonal. El método emplea la entrega adenoviral de un biosensor de AMP cíclico y un sistema de microperifusión para permitir el análisis dinámico de las respuestas de insulina y glucagón.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Diabetes tipo 1 y tipo 2
- Biología de los islotes humanos
- Dinámica de la señalización celular
Antecedentes
- Los islotes humanos son estructuras esféricas que presentan desafíos experimentales.
- El protocolo de pseudoislotes resuelve estos desafíos para la introducción efectiva de biosensores.
- Comprender la señalización de los islotes es fundamental para la investigación sobre la diabetes.
Métodos Utilizados
- Entrega mediante adenovirus para la expresión del biosensor
- Modelo primario humano de pseudoislotes
- Sistema de microperfusión para la medición de la secreción de hormonas
Resultados principales
- Registro colectivo exitoso de la señalización intracelular y la liberación de hormonas.
- Posibilitó el análisis de los efectos del silenciamiento génico en la función del islote.
- Monitoreo dinámico de las respuestas de secreción en tiempo real.
Conclusiones
- Este estudio proporciona un protocolo robusto para examinar la señalización hormonal de las islotes.
- Tiene implicaciones significativas para comprender la biología de los islotes en la diabetes.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El sistema de pseudoislotes humanos permite la evaluación sincrónica y cuantitativa de la señalización intracelular y la secreción de hormonas en células de islotes humanos primarios, abordando un cuello de botella crítico en la validación de dianas para la diabetes. Al permitir la manipulación genética y la integración de biosensores en toda la estructura tridimensional del islote, esta plataforma aumenta la confianza predictiva en estudios mecanicistas y apoya decisiones de cartera ajustadas al riesgo en la investigación de enfermedades metabólicas. La integración de este sistema con técnicas de imagen de células vivas y flujos de microperifusión lo posiciona como una herramienta reutilizable para fases tempranas del descubrimiento y para las líneas de investigación traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la vinculación de la señalización intracelular con la secreción hormonal en células de islotes humanos.
- Facilita la reducción de riesgos biológicos mediante la aclaración de vías basada en silenciamiento génico o en biosensores, en un contexto tridimensional fisiológicamente relevante.
- Apoya la confianza predictiva y la validación funcional de dianas para programas dirigidos a la diabetes y enfermedades metabólicas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Prepara sistemas validados de pseudoislotes para cribado de compuestos y ensayos mecanicistas posteriores.
- Normaliza las condiciones del ensayo para obtener mediciones reproducibles y cuantitativas de la secreción hormonal y la dinámica de biosensores.
- Permite la evaluación escalable y multiplexada de intervenciones candidatas en un modelo relevante para humanos.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Alinea los hallazgos in vitro con la biología de islotes humanos relevante para la enfermedad, facilitando el desarrollo traslacional de biomarcadores.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica, permitiendo la reducción de riesgos mecanicistas en tejido humano primario.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la integración de lecturas funcionales y de señalización.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este sistema conecta el descubrimiento inicial, la validación de dianas y la investigación preclínica al permitir la interrogación basada en hipótesis de la señalización y función de los islotes en un solo flujo de trabajo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis mecanicistas y la aclaración de vías mediante lecturas sincrónicas de biosensores y hormonas.
- Selección: Proporciona modelos de pseudoislotes listos para ensayos y reproducibles para la evaluación cuantitativa de intervenciones.
- Análisis: Ofrece mediciones dinámicas y cuantitativas de la señalización de AMPc y la secreción hormonal para comparaciones robustas entre condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta conocimientos mecanicistas in vitro con la biología de enfermedades humanas, apoyando la alineación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma estandarizada y adaptable para uso repetido en diversos programas de descubrimiento de enfermedades metabólicas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos terapéuticos para la diabetes.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, la reproducibilidad y la escalabilidad de los ensayos funcionales de islotes.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción del desarrollo y la eficiencia del capital mediante la integración de datos funcionales y de señalización.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de activos para enfermedades metabólicas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el aislamiento de islotes humanos, manipulación genética e imagenología de células vivas.
- Exige acceso a microscopía confocal, sistemas de microperfusión y análisis cuantitativo de hormonas.
- Necesita estandarización entre equipos en la preparación de pseudoislotes y protocolos de ensayo.
- Puede ser necesaria una adaptación para distintas fuentes de donantes o modelos de enfermedad.
- El rendimiento y la escalabilidad están limitados por la disponibilidad de tejido primario y la complejidad técnica.
