A multi-paramétricos Islet Sistema Perifusion dentro de un dispositivo de microfluidos Perifusion

En esta presentación, presentaremos un sistema de perfusión palpebral basado en microfluídica para la medición simultánea de la secreción dinámica de insulina, la entrada de calcio y los cambios en el potencial mitocondrial de islotes pancreáticos en respuesta a secretagogos de insulina. El sistema de perfusión está compuesto por un dispositivo microfluídico de tres capas, bombas de jeringa y un colector de fracciones de insulina. La entrada de calcio y los potenciales mitocondriales inducidos por secretagogos se visualizan mediante un montaje de microscopio fluorescente.

Hola, me llamo Ola, un Waller del laboratorio del Dr. Val Holter en el Departamento de Cirugía de Trasplantes de la Universidad de Illinois en Chicago. Hola, soy Don Lee, también del Laboratorio de Octubre. Hola, soy Tricia Hart, también del laboratorio del Dr. Al Holster.

Hoy les mostraremos un procedimiento para la obtención de imágenes simultáneas del párpado mediante un gradiente lineal de glucosa. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las imágenes y la función del ocelo. Así que comencemos.

El dispositivo microfluídico utilizado para este procedimiento se ensambla a partir de tres capas de PDMS curado generadas mediante fotolitografía estándar. La primera capa, generada a partir de un molde de silicona, tiene los pozos del dispositivo microfluídico que sujetarán suavemente los ojetes en su lugar, con una profundidad de 150 micrómetros y un diámetro de 500 micrómetros. La segunda capa tiene canales de 500 micrómetros de altura y dos milímetros de ancho.

La parte central del canal se amplía para distribuir el flujo y mejorar el intercambio de solución dentro del dispositivo; el pozo de intercambio se crea perforando un orificio de tres milímetros de alto y siete milímetros de ancho en el centro de la capa. La tercera capa es un bloque grueso de PDMS. Para preparar esta capa, haga orificios pequeños en ambos lados que coincidan con la entrada y la salida del canal.

En la segunda capa, una vez que las tres capas han sido generadas, la primera capa se une a una portaobjetos de vidrio con los pocillos orientados hacia arriba. Luego, la segunda capa se une a la primera capa con el espaciado de los canales hacia arriba. Finalmente, la tercera capa se une a la segunda capa.

Una vez que las capas han sido unidas, el dispositivo está listo para usar en experimentos. Utilizando una jeringa de 10 mililitros llena con etanol al 70 % y conectada al puerto de entrada del dispositivo con tubo Tai, esterilice el dispositivo microfluídico haciendo pasar el etanol a través de los canales del dispositivo. Luego, utilizando el mismo montaje, haga pasar agua desionizada para eliminar el etanol.

Una vez que el dispositivo haya sido esterilizado, colóquelo sobre una platina de microscopio calentada utilizando tubo de tigon, conecte las bombas de jeringa que contienen las soluciones de glucosa alta y baja a un conector en Y. Luego, conéctelo a la entrada del dispositivo microfluídico. Conecte la salida del dispositivo microfluídico a un colector de fracciones.

Asegúrese de que el tubo esté apoyado sobre una placa calefactora de 37 grados Celsius. Es muy importante mantener las soluciones a temperatura fisiológica durante todo el experimento. A continuación, utilice el programa LabVIEW para iniciar el gradiente de glucosa que se perfundirá a través de la red microfluídica durante el experimento.

Este software varía la velocidad de flujo de dos soluciones de glucosa. Al controlar las bombas de jeringa, aquí se pueden crear varios perfiles de gradiente de glucosa: lineales, en forma de campana y en forma cuadrada. En comparación con los valores esperados calculados que se muestran en este experimento, se utilizará un gradiente lineal de glucosa de dos milimolares a 25 milimolares, con una velocidad de flujo variable de 0,01 mililitros por minuto de las dos soluciones de glucosa y una velocidad de flujo constante de 0,25 mililitros por minuto que entra en el dispositivo después de mezclar las soluciones.

Una vez que se haya seleccionado el perfil de gradiente adecuado, pruebe la estabilidad del gradiente. Primero, inicie el sistema de gradiente. Luego, inicie el recolector de fracciones y recoja ocho perfusiones en tubos de un mililitro.

Luego, utilizando un glucómetro, pruebe la concentración de glucosa en cada tubo usando Excel. Analice los resultados obtenidos del glucómetro. A continuación, sustituya la jeringa de alta glucosa por una jeringa que contenga una solución de BSA al 0,5 % en tampón Krebs-Ringer y perfunda 50 mililitros a través del dispositivo a una velocidad de un mililitro por minuto.

Esto evitará la absorción inespecífica de insulina en las paredes del microcanal para garantizar la precisión al medir posteriormente los niveles de insulina secretada tras la perfusión con BSA. Reemplácelo con la solución de glucosa alta reus. Suspenda de 25 a 30 islotes pancreáticos de ratón seleccionados manualmente en un tampón de Krebs-Ringer que contenga dos milimoles por litro de glucosa y los colorantes indicadores de calcio fura 2:00 AM y de potenciales mitocondriales rhodamina 1 2 3, e incube durante 30 minutos a 37 grados Celsius.

Después de la incubación, desconecte el dispositivo del sistema de perfusión y cargue cuidadosamente los islotes en el dispositivo microfluídico insertando la punta de la pipeta, que contiene los islotes, en el puerto de entrada, y dispensando lentamente los islotes. Tras la carga, reconecte el dispositivo al sistema de perfusión, teniendo cuidado de no introducir burbujas. A continuación, inicie la bomba de jeringa para comenzar la perfusión de los islotes con KRB que contiene dos milimolares de glucosa.

Este paso eliminará el exceso de colorante del medio, establecerá los conjuntos de filtros de excitación y emisión y los tiempos de exposición que se utilizarán durante el experimento. Luego, configure el colector de fracciones para recolectar a intervalos de un minuto mientras pasa por los orificios con la solución de glucosa baja. Utilice la herramienta de región de interés o ROI del software de imagen Simple PCI para definir las áreas u orificios que desea imaginar.

Además, marque con un círculo el área de fondo que se restará después de que las células hayan sido lavadas durante 10 minutos, inicie el colector de fracciones con gradiente de glucosa y comience la adquisición de imágenes con lapso de tiempo. Después de 30 minutos, apague el software y la bomba de jeringa de glucosa alta. Continúe perfundiendo con glucosa baja para eliminar el efecto de la glucosa alta.

Después de 10 minutos, detenga el flujo de glucosa baja apagando la bomba de jeringa. Tras la perfusión, exporte los datos a Excel para su análisis. La cantidad de insulina secretada en el perfusato puede determinarse mediante elisa en ojales de ratón.

Se perfundieron con un gradiente lineal de dos a 25 milimolares de glucosa, como se muestra aquí. La entrada de calcio y la secreción de insulina se desencadenan tras aproximadamente 13 minutos de perfusión, correspondientes a seis milimolares de glucosa. Los cambios en los potenciales mitocondriales se observan antes, como era de esperar, alrededor de los 11 minutos.

Estos datos demuestran la ventaja de utilizar esta red microfluídica para caracterizar la fisiología de los ocelos. Acabamos de mostrarle cómo usar nuestro dispositivo microfluídico de perfusión para el estudio de la fisiología de los ocelos. Al realizar este procedimiento, es importante recordar asegurarse de que no haya burbujas en el dispositivo, ya que esto podría provocar que los ocelos se muevan durante un experimento.

Además, el flujo puede ajustarse hasta un ml por minuto sin perturbar los ojales. Eso es todo. Gracias por verlo y buena suerte con su experimento.