Aplicación de grafeno monocapa a rejillas de criomicroscopía electrónica para la determinación de estructuras de alta resolución
10 de noviembre de 2023
La aplicación de capas de soporte a rejillas de microscopía electrónica criogénica (crioEM) puede aumentar la densidad de partículas, limitar las interacciones con la interfaz aire-agua, reducir el movimiento inducido por el haz y mejorar la distribución de las orientaciones de las partículas. Este artículo describe un protocolo robusto para recubrir rejillas crioEM con una monocapa de grafeno para mejorar la preparación de muestras criogénicas.
Un desafío común en la preparación de muestras de criomicroscopía electrónica es la localización de partículas en la interfaz aire-agua, lo que hace que las partículas adopten orientaciones preferidas y se desnaturalicen. En cambio, es mejor que las partículas descansen en la superficie de la rejilla, que promueven los soportes de película delgada, como el grafeno. Otro desafío es el requisito de concentraciones de muestra relativamente altas, que también podrían abordarse con grafeno.
Las rejillas recubiertas de grafeno ofrecen numerosas ventajas para la determinación de la estructura crioEM, pero históricamente han sido difíciles de fabricar internamente de forma reproducible, así como un coste prohibitivo para su compra comercial. Este protocolo permite la deposición robusta de grafeno monocapa, lo que reduce la barrera para que los usuarios empleen estas rejillas en su investigación. El grafeno es único debido a las propiedades de su material.
Es una monocapa de carbono y, por lo tanto, presenta un ruido de fondo mínimo. Otros soportes de rejilla crioEM, como una capa delgada de carbono amorfo o escamas de óxido de grafeno, no se pueden aplicar como una sola monocapa y contribuyen con más señal de fondo. Ahora que hemos establecido un protocolo robusto para la aplicación de grafeno a las rejillas crioEM, nos gustaría continuar con la funcionalización de rejillas recubiertas de grafeno con mangos de afinidad para la captura en la red directamente de lisados celulares.
Esto podría aliviar otro cuello de botella en la preparación de muestras crioEM.
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Resumen
Este artículo presenta un protocolo para recubrir rejillas de microscopía electrónica criogénica (cryoEM) con una monocapa de grafeno. El uso de grafeno aumenta la densidad de partículas, minimiza las interacciones con la interfase aire-agua y mejora la distribución de la orientación de las partículas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microscopía electrónica criogénica
- Ciencia de materiales
- Técnicas de preparación de muestras
Antecedentes
- La localización de partículas en la interfase aire-agua es un desafío común en microscopía electrónica criogénica.
- Las orientaciones preferidas pueden provocar la desnaturalización de las partículas.
- Los soportes de grafeno pueden ayudar a que las partículas reposen sobre la superficie de la rejilla.
- Tradicionalmente, la fabricación de rejillas recubiertas con grafeno ha sido difícil y costosa.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo robusto para la deposición de grafeno monocapa en rejillas de criomicroscopía electrónica.
- Reducir las barreras que enfrentan los investigadores para utilizar rejillas recubiertas con grafeno.
- Mejorar las ventajas del determinación estructural mediante criomicroscopía electrónica.
Métodos Utilizados
- Desarrollo de un protocolo para el recubrimiento con grafeno.
- Evaluación de la densidad y orientación de las partículas.
- Comparación de rejillas recubiertas con grafeno frente a rejillas tradicionales.
- Evaluación de la reproducibilidad en la fabricación de rejillas.
Resultados Principales
- Las rejillas recubiertas con grafeno mejoran significativamente la localización de partículas.
- La mayor densidad de partículas permite una mejor determinación de la estructura.
- Un protocolo robusto facilita la fabricación interna de rejillas de grafeno.
- Costos más bajos y mayor accesibilidad para los investigadores.
Conclusiones
- El uso de grafeno en rejillas de microscopía electrónica criogénica aborda desafíos clave en la preparación de muestras.
- Este protocolo permite una adopción más amplia de rejillas recubiertas con grafeno en la investigación.
- Las propiedades únicas del grafeno mejoran las capacidades de la microscopía electrónica criogénica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los cuellos de botella en la preparación de muestras en microscopía electrónica criogénica (crioEM) limitan el rendimiento y la fiabilidad de la determinación de estructuras de alta resolución en fases tempranas del descubrimiento y en los flujos de trabajo de biología estructural. La aplicación de grafeno en monocapa a las rejillas de crioEM aborda desafíos críticos relacionados con la localización de partículas, el sesgo de orientación y los requisitos de concentración de la muestra, afectando directamente la confianza predictiva en la validación de objetivos y en estudios mecanicistas. Protocolos sólidos y reproducibles para rejillas de grafeno permiten una adopción más amplia a nivel empresarial, apoyando el avance de carteras ajustado al riesgo y una asignación eficiente de recursos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación estructural de alta fidelidad de objetivos macromoleculares a resolución cercana al átomo.
- Reduce la desnaturalización de la muestra y el sesgo de orientación, apoyando la eliminación de riesgos mecanicistas.
- Facilita la validación confiable de objetivos al mejorar la densidad de partículas y la consistencia de la imagen.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Prepara soportes de rejilla estandarizados y reproducibles para flujos de trabajo posteriores de criomicroscopía electrónica (cryoEM).
- Mejora la fiabilidad del ensayo al minimizar el ruido de fondo y potenciar los resultados cuantitativos de imágenes.
- Permite la realización de cribados a gran escala de complejos estructuralmente diversos a concentraciones más bajas de muestra.
Investigación Translacional y Preclínica
- Permite estudios estructurales de complejos relevantes para enfermedades, apoyando la alineación de biomarcadores traslacionales.
- Proporciona continuidad desde la elucidación estructural en fase de descubrimiento hasta la validación preclínica de mecanismos moleculares.
- Reduce el riesgo de fallos biológicos en fases avanzadas al garantizar la calidad de los datos estructurales.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
La preparación de rejillas de grafeno monocapa se integra en el flujo de trabajo de microscopía crioelectrónica desde el descubrimiento inicial hasta la identificación de compuestos prometedores y la investigación preclínica, apoyando la determinación estructural guiada por hipótesis y el conocimiento mecanicista.
- Biología del Descubrimiento: Apoya pruebas rigurosas de hipótesis nulas al permitir comparaciones estructurales precisas entre condiciones.
- Detección: Proporciona rejillas reproducibles y de bajo fondo para la cuantificación mediante imágenes y la estandarización de ensayos.
- Análisis: Ofrece patrones de difracción y mapas de densidad de alta calidad para análisis estadístico y toma de decisiones.
- Investigación Traducional: Mantiene la continuidad de los datos estructurales para dianas y complejos relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad escalable y reproducible de preparación de rejillas para diversos programas de I+D.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios estructurales.
- Valor operativo: Estandariza la preparación de rejillas, mejora la reproducibilidad y disminuye los requisitos de entrada de muestra.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al reducir los cuellos de botella en la preparación de muestras.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de objetivos validados estructuralmente.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de grafeno y en la preparación de rejillas para microscopía crioelectrónica (cryoEM).
- Necesita acceso a centrifugadoras de disolución (spin coaters), unidades de descarga de plasma (glow discharge) y limpiadores de ozono UV.
- Exige una estandarización entre equipos para garantizar la reproducibilidad y la comparabilidad de los datos.
- Puede ser necesaria una adaptación según el sistema macromolecular o tipo de muestra.
- Las limitaciones prácticas incluyen la manipulación de materiales frágiles y la garantía de la integridad de la monocapa durante la transferencia.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
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Introduction
1:35
Preparing MMA‐Coated CVD Graphene for Fabrication of Graphene‐Coated CryoEM Grids
3:27
Preparing Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares for Attaching to CryoEM Grids
5:14
Fabricating Graphene‐Coated Cryo‐EM Grids Using Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares
