Un método sencillo y rápido para el aislamiento simultáneo de islotes primarios y células acinares pancreáticas primarias de ratones

Este estudio desarrolló un método simplificado para extraer eficientemente islotes primarios funcionales y células acinas del páncreas del ratón, ofreciendo una herramienta valiosa para estudiar la comunicación intracelular en la patogénesis de la diabetes PPDMA inducida por pancreatitis aguda. Los métodos actuales para aislar islotes primarios de ratones se basan principalmente en la canulación de conductos biliares. Esta técnica requiere una localización precisa y canulación del conducto biliar, seguida de una perfusión in vivo de la solución de colagenosa P del parenquima pancreático.

Es bastante difícil de realizar sin formación especializada, y lograr una perfusión pancreática eficaz y eficiente es todo un reto. Este vídeo impide un método sencillo y rápido para aislar islotes de montaje primario, adecuado para investigadores sin experiencia en perfusiones. El método también permite la adquisición simultánea de células acinas pancreáticas primarias, lo que produce una cantidad suficiente de islotes y células acinares de alta calidad.

Permite a los investigadores realizar experimentos dentro del mismo contexto patológico y fisiológico, facilitando así un análisis en profundidad del mecanismo de interacción entre los islotes y las células acinares. Aislamiento de islotes pancreáticos y PACs de células acinares pancreáticas. Añade la solución salina equilibrada de Hank y la solución de colagenasa P a la placa de 12 pozos y añade tres mililitros de solución de colagenasa P a un tubo centrífuga de 50 mililitros para la digestión posterior.

Anestesiar al ratón con 1,25% de tribromoetanol antes de la cirugía y luego la eutanasia. Haz una incisión abdominal en forma de V para abrir la cavidad abdominal del ratón. El órgano linfoide rojo oscuro en la región hipocondríaca izquierda es el bazo, y el órgano blanco unido al bazo es el páncreas.

Realizar cuidadosamente una disección roma del páncreas a lo largo del borde inferior del estómago y la unión pancreaticoduodenal. Lava el tejido pancreático aislado con la solución salina equilibrada de Hank y elimina las adherencias mesentéricas residuales, el bazo y el tejido adiposo peripancreático. Mueve el páncreas preprocesado a una placa de 12 pozos preañadida con dos mililitros de solución de colagnasa P.

Sujeta el páncreas en su lugar con pinzas con la mano izquierda y utiliza una jeringuilla de un mililitro con la mano derecha para inyectar la solución de colagenasa P en el parénquima pancreático hasta que el tejido pancreático parezca translúcido y edematoso. Corta el páncreas en fragmentos de tejido de uno a dos milímetros en cubos rápidamente con tijeras quirúrgicas. Corta la punta distal a 1,5 centímetros de una punta de pipeta de un mililitro para agrandar la abertura, y utiliza esta punta modificada para transferir los fragmentos de tejido pancreático junto con dos mililitros de solución de colagenasa P a un tubo centrífugo de 50 mililitros precargado con tres mililitros de solución de colagnasa P.

Incuba el tubo de la centrífuga en un baño maria a 37 grados Celsius durante 12 minutos, agitando suavemente el tubo cada cinco o seis minutos durante este periodo. Añade 10 mililitros de medio completo RPMI 1640 para terminar el efecto digestivo de la solución de colagenasa P. Pipetea el pellet repetidamente con una pipeta Pasteur de cinco mililitros, de 15 a 20 movimientos de arriba y vuelta, hasta que no queden grumos grandes de tejido evidentes.

Añade 10 mililitros de RPMI 1640 full medium. Luego centrifugar a 180 veces G durante dos minutos a cuatro grados Celsius. Y descartar el sobrenadante: Resuspender el proyectil con 20 mililitros de medio completo RPMI 1640.

Filtra la suspensión a través de un colador de 40 mallas. Luego centrifugar a 180 veces G durante dos minutos a cuatro grados Celsius. Descarta el sobrenadante con cuidado.

Añade 20 mililitros de solución Ficoll para volver a suspender el pellet. Luego añade lentamente 15 mililitros de RPMI 1640 full medium. En este punto, se puede observar una interfaz líquida clara.

Centrifuga suavemente a 640 veces G durante 20 minutos a 25 grados Celsius. Retira cuidadosamente el tubo de la centrífuga y aspira la capa superior de medio rojo usando una pipeta Pasteur de cinco mililitros. Luego, aspira cuidadosamente los islotes que contienen el líquido en la interfaz de la capa líquida y transfiere a un nuevo tubo centrifugador de 50 mililitros.

Añade 20 mililitros de RPMI 1640 full medium. Centrifugar a 180 veces G durante dos minutos a cuatro grados Celsius y descartar el sobrenadante. Resuspende el proyectil con 20 mililitros de medio completo RPMI 1640.

Centrifugar a 180 veces G durante dos minutos a cuatro grados Celsius y descartar el sobrenadante. Resuspende el proyectil con 10 mililitros de medio completo RPMI 1640. Y transfiero a una placa de cultivo celular de 60 milímetros.

Bajo un microscopio biológico invertido con 100 veces más aumento, elegir manualmente los islotes usando una pipeta de 20 microlitros. Transfiere los islotes seleccionados a una placa de cultivo celular de 24 pozos precargada con 500 microlitros de medio completo RPMI 1640 por pozo. Descarta la capa de solución de Ficoll.

Resuspende el pellet con 10 mililitros de medio completo DMEM. Filtra a través de un colador de celdas de 100 micrómetros. Centrifugar a 180 veces G durante dos minutos a cuatro grados Celsius.

Y desechar al sobrenadante. Resuspende el pellet con 10 mililitros de medio completo DMEM. Centrifugar a 180 veces G durante dos minutos a cuatro grados Celsius y descartar el sobrenadante.

Luego, resuspende el pellet con cinco mililitros de medio completo DMEM para experimentos posteriores. Tras la centrifugación por gradiente de densidad de solución de Ficoll, se observaron islotes cerca de la interfaz entre la capa líquida transparente e incolora y el medio con paquetes presentes como sedimento en el fondo del tubo. Los islotes eran generalmente ovalados y redondos, de color marrón dorado, con un rendimiento estable de 120 más o menos cinco por ratón, Figura A y Figura B. Los PACs recién aislados eran esféricos y agrupados.

Las células acinares tenían extremos apicales más oscuros con gránulos de zimógeno visibles y el rendimiento era de 1,6 a 1,95 por 10 a las células de potencia séptima por ratón, Figura C y D. La tinción PI de islotes y células acinares de claceína muestra que la mayoría de las células tintaban calceína verde, vivo y pocas PI rojas, muertas, Figura A. El análisis cuantitativo basado en J de la imagen revela que los islotes aislados y las células acinares tienen tasas de viabilidad de 97,52 más o menos 0,16% y 96,55 más o menos 0,95% respectivamente, Figura B. Células acinares pancreáticas aisladas, una actividad basal amilasa de 0,79 más o menos 0,01 unidades por mililitro. Tras la estimulación con 10 nanomolares, 20 nanomolares y 50 nanomolares de caeruleina, sus actividades de amilasa fueron de 1,45 más o menos 0,03 unidades por mililitro, 1,65 más o menos 0,05 unidades por mililitro, y 1,39 más o menos 0,02 unidades por mililitro, respectivamente. La ANOVA unidireccional mostró que todos los grupos de ceruleína tenían una actividad amilasa significativamente diferente respecto al grupo de control, todos los valores de P inferiores a 0,001.

Además, el grupo 20 nanomolar difería significativamente del grupo de 10 nanomolares, valor P menor a 0,001, figura A. Islotes aislados con secreción de insulina de 0,27 más o menos 0,04 nanogramos por mililitro por islote por hora cuando estimulados con 5,6 milimolares de glucosa y 0,94 más o menos 0,04 nanogramos por mililitro por islote por hora con 22 milimolares de glucosa, GSI es 3,44, Figura B. Este estudio estableció un método para el aislamiento simultáneo de islotes primarios de ratón y células acinas pancreáticas sin perfusión compleja in vivo. Con una barrera técnica larga, el método es fácil de operar, produciendo 120 islotes más o menos 5 y 1,6 a 1,95 veces 10 a la séptima potencia por ratón, con ambos tipos celulares mostrando una tasa de viabilidad superior al 96%. Los islotes aislados presentan una secreción normal de insulina estimulada por glucosa y las células acinas son sensibles a la estimulación de la cerúlea. Esto confirma que las células obtenidas mediante este método tienen funciones intactas, lo que las hace adecuadas para estudios sobre interacciones exócrinas pancreáticas y endocrinas.

Sin embargo, el método está limitado por la necesidad de conocimientos básicos de anatomía del ratón, la necesidad de ajustar la dosis de los reactivos, las restricciones en el número de ratones procesados simultáneamente y el riesgo de aplicación no validada. Sigue proporcionando un protocolo fiable de aislamiento celular para investigadores que carecen de experiencia en perfusión.