Aislamiento de ratón Islet Langerhans utilizando una combinación de colagenasa purificada y proteasa neutra
7 de septiembre de 2012
Una descripción detallada de ratón aislamiento de islotes se describe utilizando la técnica de canulación en pancreático ductal in situ y la perfusión de una combinación de colagenasa purificada y proteasa neutra.
El objetivo general de este procedimiento es aislar con éxito los islotes de un páncreas de ratón. Esto se logra primero aislando el páncreas del tejido circundante. A continuación, se canula el conducto biliar para que el páncreas pueda inflarse con la mezcla de colagenasa y proteasa.
Una vez inflado, se extrae el páncreas y los islotes se disocian cuidadosamente. Finalmente, los islotes aislados se filtran y siembran para su uso futuro. En definitiva, este método de aislamiento de islotes con colagenasa purificada y proteasa neutra se utiliza para obtener un rendimiento máximo de islotes y una morfología óptima de los mismos.
La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes de aislamiento de anillos traqueales es que hemos eliminado la variabilidad entre lotes mediante el uso de enzimas purificadas. Además, hemos modificado o mejorado algunos protocolos para mejorar la morfología de los anillos traqueales. Tras la eutanasia, cubra el torso con etanol al 70 % antes de abrir completamente la cavidad abdominal desde el ano hasta el diafragma.
A continuación, coloque el ratón sobre la plataforma de un microscopio de disección. Saque el ciego y el colon ascendente y colóquelos fuera de la cavidad corporal hacia el lado izquierdo; desplace los lóbulos del hígado contra el diafragma. Si no permanecen en esa posición por sí solos, aumente la abertura de la cavidad corporal.
Sujete el duodeno con fórceps curvos y localice el haz de la arteria hepática, la vena porta y el conducto biliar que conduce al hígado. Con otro par de fórceps curvos, inserte una sutura debajo del haz de la arteria, la vena y el conducto, y apriétela lo más cerca posible del hígado.
Utilizando dos pares de pinzas curvas, agarrar cuidadosamente el duodeno y localizar el conducto biliar en la papila. Con una punta de la pinza, perforar el páncreas y el tejido conectivo justo debajo del conducto biliar y cerca de la papila. Rápidamente, pasar la pinza a través del orificio e insertar una sutura, de forma suelta. Amarar la sutura alrededor del conducto biliar para formar un pequeño círculo utilizando pinzas de 90 grados.
Extraiga el intestino delgado hasta que el conducto biliar quede tenso. Realice un corte horizontal a través de la papila con tijeras muy finas sin desalojar el conducto biliar de la papila mientras sostiene el intestino. Introduzca una cánula en el conducto biliar y luego tense suavemente la sutura alrededor de la cánula.
A continuación, llene una jeringa de tres mililitros con 2,0 mililitros de la mezcla de colagenasa y proteasa. Inyecte esta mezcla en la cánula a un ritmo lento y constante. Una vez completada la inflación del páncreas, retire la cánula del conducto biliar.
Comenzando en el colon descendente, corte el tejido conectivo mientras se tira de los intestinos hacia arriba hasta alcanzar el conducto biliar. A continuación, separe el páncreas del bazo y de los tejidos circundantes. Finalmente, corte las suturas y retire el páncreas.
Una vez extraído, coloque el páncreas en un tubo de 50 mililitros que contenga cinco mililitros de HBSS sobre hielo. Una vez recolectadas todas las muestras, coloque los tubos de 50 mililitros que contengan tejido pancreático en un baño de agua a 37 grados Celsius. Agite suavemente el tubo durante 15 minutos y verifique la disociación del tejido.
Asegúrese de que el tejido se separe fácilmente sosteniendo el tubo por la tapa. Agite girando 12 veces para disociar aún más el tejido. Añada no más de 30 mililitros de HBSS y centrifugue.
Aspire cuidadosamente el sobrenadante y deje una pequeña cantidad de sobrenadante en el fondo para no perturbar la paleta celular. Utilizando una jeringa de 30 mililitros conectada a una aguja de calibre 14, agregue no más de 10 mililitros de HBSS y aspire la suspensión hacia arriba y hacia abajo dos veces. Filtre la mezcla celular a través de un colador plástico en forma de T hacia un tubo de 50 mililitros.
Lave con otros 10 mililitros de HBSS y centrifugue. Deseche el sobrenadante e invierta los tubos para drenar sobre una toalla de papel absorbente durante un minuto. Reuspenda cada tubo en 10 mililitros.
Frío 1100. Su capa opaca, la capa opaca con 10 mililitros, HBSS y centrifugar. Retire los 20 mililitros completos del sobrenadante utilizando una pipeta grande de 25 mililitros y pase el sobrenadante a través de un filtro invertido de 70 micrones.
Filtre los organoides oculares directamente en una placa de Petri y enjuáguelos pipeteando 10 mililitros de medio para organoides oculares a través del cultivo filtrado. Mantenga los organoides oculares en un incubador de cultivo de tejidos hasta que estén listos para el experimento. Los rendimientos, la morfología y la calidad de los organoides oculares son los parámetros generales utilizados para evaluar el éxito del aislamiento de organoides oculares.
Se muestra aquí la morfología típica de los islotes. Los islotes tienen una forma redonda a oblonga con un tamaño relativamente uniforme. Aquí, los islotes aislados fueron analizados para la secreción de insulina estimulada por glucosa.
La estimulación con insulina fue similar entre los islotes preparados con Sigma Type 11 en comparación con ci zyme TM, MABP, lo que indica una alta calidad en la preparación de los islotes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo canular el conducto biliar de un ratón. Trabaje con colagenasa zyme y neutroproteasas para aislar sus islotes para cualquier ensayo.
Descripción general
Este artículo describe un procedimiento detallado para aislar islotes del páncreas de un ratón mediante la canulación ductal pancreática in situ y una mezcla de colagenasa-proteasa. El método tiene como objetivo mejorar el rendimiento y la morfología de los islotes, al mismo tiempo que minimiza la variabilidad.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Endocrinología
Antecedentes
- Las células de los islotes son cruciales para la producción de insulina.
- Los métodos tradicionales de aislamiento pueden provocar variabilidad en los resultados.
- El uso de enzimas purificadas puede mejorar la calidad de los islotes aislados.
- Protocolos mejorados pueden conducir a una mejor morfología de los islotes.
Objetivo del estudio
- Aislar eficazmente islotes del páncreas de ratón.
- Reducir la variabilidad entre lotes en las preparaciones de enzimas.
- Optimizar la morfología de los islotes para aplicaciones de investigación.
Métodos Utilizados
- Aislamiento del páncreas del ratón de los tejidos circundantes.
- Canulación del conducto biliar para la infusión de enzimas.
- Inflado del páncreas con una mezcla de colagenasa-proteasa.
- Filtrado y siembra de islotes aislados para experimentación.
Resultados principales
- Disociación y aislamiento exitosos de islotes pancreáticos.
- Morfología mejorada de islotes pancreáticos observada tras el aislamiento.
- Preparaciones de islotes pancreáticos de alta calidad indicadas por pruebas de secreción de insulina.
- El método demostró una variabilidad reducida en comparación con las técnicas tradicionales.
Conclusiones
- El método descrito es eficaz para aislar ojales de alta calidad.
- El uso de enzimas purificadas mejora la fiabilidad de los resultados.
- Esta técnica puede ser beneficiosa para diversos ensayos que involucran ojales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento de islotes pancreáticos primarios permite la evaluación de la función de las células beta en un contexto fisiológicamente relevante, lo cual es fundamental para la validación de dianas en diabetes y la reducción mecanicista de riesgos. La variabilidad en el rendimiento de los lotes de enzimas compromete la reproducibilidad entre campañas de descubrimiento, afectando la identificación de compuestos prometedores y la confianza predictiva. Este protocolo aborda la inconsistencia entre lotes mediante el uso de colagenasa y proteasa neutra purificadas, favoreciendo la preparación estandarizada y escalable de islotes para evaluaciones preclínicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la exploración de vías de señalización intracelular y respuestas secretoras en islotes primarios, mejorando la validación de hipótesis sobre dianas.
- Valor operativo: Reduce el ruido biológico derivado de la variabilidad enzimática, aumentando la confianza en las lecturas de interacción con la diana.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona un rendimiento y una morfología consistentes de islotes para ensayos fiables de secreción de insulina estimulada por glucosa.
- Valor operativo: La composición estandarizada de enzimas favorece la reproducibilidad del ensayo entre laboratorios y campañas de cribado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la biología de las células beta relevante para enfermedades en estudios preclínicos de eficacia y toxicidad.
- Valor operativo: Facilita la comparabilidad entre cepas cuando las proporciones de enzimas se ajustan según las características tisulares específicas de cada especie.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y las pruebas de eficacia preclínica, donde la función de los islotes primarios orienta las decisiones de continuar o descartar.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la aclaración de vías y la validación funcional de dianas mediante respuestas de islotes similares a los humanos fisiológicamente relevantes.
- Selección: Permite la evaluación estandarizada y cuantitativa de los efectos de compuestos sobre la secreción de insulina.
- Análisis: Genera variables dependientes mensurables, como los niveles de secreción de insulina y el rendimiento de islotes, para el análisis comparativo de condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta la modulación de dianas en fase de descubrimiento con resultados preclínicos mediante la conservación de la morfología y función de los islotes.
- Reutilización Empresarial: Los lotes de enzimas purificados permiten la reutilización del protocolo en diversos proyectos, reduciendo la necesidad de reoptimización.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mayor confianza predictiva en la validación de objetivos mediante la reducción de la ambigüedad mecanicista en las respuestas de las células beta.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad del aislamiento de islotes entre distintos centros y estudios.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, mayor eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas en programas contra la diabetes.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo basada en datos funcionales fiables derivados de islotes.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en disección de ratones y canulación del conducto pancreático.
- Depende del acceso a colagenasa purificada (CIzyme MA) y proteasa neutra (CIzyme BP) con actividad caracterizada.
- Necesita la estandarización de las proporciones de enzimas (por ejemplo, 35:10 colagenasa:proteasa) para un rendimiento constante.
- Puede ser necesaria una adaptación para cepas distintas de C57BL/6 o modelos de rata, según la densidad del tejido y la accesibilidad de las enzimas.
- Límite práctico: los pasos de disección e inflado manuales limitan el rendimiento sin automatización.
