Ensayo de inmunofluorescencia multiplexado para la evaluación espacial de marcadores de senescencia in vivo
24 de julio de 2026
La inmunofluorescencia multiplexada permite el marcado secuencial de múltiples marcadores de anticuerpos dentro de una sola sección tisular para apoyar el análisis espacial de la arquitectura tisular y las poblaciones celulares. Aquí se presenta un flujo de trabajo para la detección multiplex de marcadores estructurales, estructural e inmunitarios asociados a la senescencia, que incluye preparación manual y automatizada de portaobjetos, imágenes iterativas y análisis de células individuales utilizando software digital de patología.
El análisis espacial de las células senescentes es importante para comprender su contribución a procesos como el envejecimiento, el cáncer, la inmunidad y la homeostasis de tejidos normales. La detección de células senescentes se basa en el perfilado de múltiples biomarcadores. La inmunofluorescencia multiplex permite el perfil de alto rendimiento de estos dentro de una sola sección de tejido.
Para empezar, verifica que las secciones de tejido fijadas en formalina, incrustadas en parafina o FFPE, de 5 micrómetros de espesor, con un tamaño máximo de 4 x 2 centímetros cuadrados, estén montadas centralmente sobre portaobjetos de microscopía cargadas positivamente y sean claramente visibles dentro de la ventana de visualización del portaobjetos sin cubierta. Realiza los pasos de preparación de la muestra, ya sea manualmente usando una cámara de desocultación o automáticamente mediante un teñidor automático. Coloca las láminas preparadas en el portadeslizantes sin cubierta.
Alinea los bordes superior y derecho contra los topes metálicos. Bloquea la corredera con ambas manos a la vez para girar las levas de plástico a la posición cerrada con candado. Verifica que el deslizador esté completamente plano y no se balancee dentro del portacarga.
Coloca el ClickWell, inserta la cámara sobre la corredera y aprieta las barras laterales con ambas manos para limitar la presión y evitar roturas. Carga el pozo de clic con 2 mililitros de medio de montaje que contiene un 50% de glicerol en solución salina tamponada con fosfato a través del puerto de entrada. Añade una etiqueta de código de barras en el lado izquierdo de la lámina en cualquiera de las dos orientaciones y luego procede a la imagen.
Para la selección de regiones y el análisis de autofluorescencia, abre la versión 4204 de Mx Workflow, software de adquisición de imágenes multiplexadas. Haz clic en Herramientas para seleccionar Editor de protocolos. En la ventana emergente Multiplex Protocol Publisher, introduce el nombre del protocolo.
Haz clic en Crear Ronda de Configuración, seguido de añadir Siguiente Ronda de Protocolo para crear varias rondas de etiquetado de biomarcadores. Haz clic en Publicar y luego selecciona Aceptar en la ventana emergente. Adquiere el canal Cy3 para imágenes virtuales de H&E.
Haz clic en Slide y luego Crear un nuevo lote. Tras seleccionar el nombre del protocolo, introduce el ID de la diapositiva. Haz clic en Añadir diapositiva y luego selecciona Crear lote para crear un flujo de trabajo de experimento multiplex. Abre el software de adquisición Cell DIVE.
Haz clic en Cargar para cargar la lámina en el microscopio. En el menú desplegable de Herramientas, haz clic en el icono de la cuadrícula para definir las regiones deseadas y utiliza la herramienta Mover para reposicionar las regiones definidas. A continuación, utiliza la herramienta Dibujar para deseleccionar cualquier campo que no sea necesario, asegurándote de que cada campo de visión tenga al menos dos campos de visión vecinos para evitar problemas de costura, y haz clic en Guardar regiones.
En la ventana de flujo de trabajo MX, haz clic en Viewer QC para abrir la página del visor de Cell DIVE y visualizar la imagen del tejido con ampliación 10x. Haz clic en el icono de corrección de imagen para ajustar el brillo de la imagen y haz clic en Enviar control de calidad para seleccionar Pasar y Recargar Deslizamiento en la ventana emergente. Cuando la imagen se recargue, haz clic en Agregar ROI para dibujar y ajustar las regiones de interés.
Selecciona los campos de visión deseados y repite la suma de ROI. A continuación, haz clic en Enviar al laboratorio. Carga la diapositiva para iniciar la adquisición de imagen con autofluorescencia 20x.
En el menú de Control de calidad de imagen, seleccione la casilla correspondiente al ID específico de la diapositiva y luego haga clic en Comprobante de calidad del visor. Haz zoom en la imagen cargada para escanear regiones desenfocadas o artefactos. Revisa las imágenes de fondo de cada canal, que se restarán de la señal final del biomarcador. Haz clic en Enviar control de calidad, luego selecciona Pasar y Salir para generar imágenes de fondo.
Antes de la tinción secuencial de biomarcadores, centrifugar los anticuerpos a 13.000 G durante un minuto a temperatura ambiente para limitar los artefactos. Preparar la solución de anticuerpos a una dilución de 1 en 200 en solución salina tamponada con fosfato, o PBS, que contiene 0,3% de albúmina sérica bovina, o BSA. Quita el medio de montaje pipeteando desde el puerto ClickWell.
Y lava tres veces con 2 mililitros de PBS que contenga 0,01% Tween 20 o PBST durante 5 minutos. Añade 350 microlitros de solución de anticuerpos en el puerto para asegurar una cobertura completa de la muestra dentro de la cámara de tinción. Incuba durante una hora a temperatura ambiente.
A continuación, extrae la solución de anticuerpos por pipete desde el puerto ClickWell. Y lava tres veces con 2 mililitros de PBST durante 5 minutos. Añade 2 mililitros de soporte de montaje.
Introduce el soporte ClickWell en el microscopio y carga la lámina para iniciar la imagen de biomarcadores 20x. Realiza la QC de imagen usando el editor de mezcla y las opciones de corrección de imagen y envía la evaluación de QC de imagen. Extrae el soporte de montaje por el puerto ClickWell y lava tres veces con 2 mililitros de PBST durante 5 minutos.
Prepara la solución de inactivación del tinte de forma fresca antes de usarla. Después de retirar PBST, añade 2 mililitros de solución inactivadora de colorante para cada portaobjetos. Incuba durante 15 minutos en el portaportaobjetos.
Extrae la solución de inactivación del tinte del puerto ClickWell y lava con 2 mililitros de PBST durante 5 minutos. Añade 2 mililitros de medio de montaje e inserta el soporte ClickWell en el microscopio para iniciar una imagen autofluorescente automática específica de ronda 20x. Avanza en el flujo de trabajo pasando los pasos de control de calidad indicados en pantalla al finalizarlo.
Repite la tinción secuencial, la inactivación de colorantes y la imagen multiplexada para tantos marcadores como sea necesario, y continúa hasta finalizar. Utiliza el software HALO para seleccionar varios canales que visualizen la localización de marcadores en distintas regiones del núcleo tisular. Haz clic en Analizar y selecciona Imagen Completa para analizar las métricas cuantitativas de los marcadores individuales.
Haz clic en Resultados para ver el número total de células en el núcleo tisular analizado y el subconjunto de células que expresan marcadores específicos. En comparación con el método automatizado basado en teñidor de diapositivas, el método manual basado en cámara de desocultación resultó en una mayor frecuencia de artefactos tisulares caracterizados específicamente por desprendimiento de tejido así como por pérdida o desprendimiento de núcleos. La cuantificación realizada con software de patología digital en tejido pancreático representativo reveló que las células p16 positivas estaban asociadas con niveles más bajos de LB1 y viceversa, demostrando un perfil consistente con los patrones de marcadores asociados a la senescencia.
Un mapa de calor normalizado con puntuación Z ilustra la distribución del fenotipo de senescencia p16 positivo lamina-B1 negativo en varios tejidos, revelando altas concentraciones de células senescentes en el pulmón, glándulas suprarrenales y pituitarias, correspondientes a niveles elevados de p16 y disminución de LB1. Por el contrario, el apéndice, el ganglio linfático y el bazo mostraron baja senescencia, manteniendo alta expresión de LB1 y baja expresión de p16. Este protocolo permite sondear una combinación de biomarcadores de senescencia, estructurales e inmunitarios dentro de una sola lámina de microscopía.
Combinando múltiples marcadores dentro de una sola muestra, se puede realizar un análisis espacial de la arquitectura tisular y la distribución celular senescente. Las aplicaciones futuras incluyen el perfilado a gran escala de biomarcadores de senescencia a través de múltiples tipos de tejidos y la integración con ómicos espaciales para resolver mejor la heterogeneidad celular.
Descripción general
Este artículo presenta un protocolo integral para la tinción de inmunofluorescencia multiplexada (IF), que permite la detección simultánea de múltiples marcadores de anticuerpos dentro de una única sección de tejido. El método es especialmente adecuado para el perfilado de células senescentes en diversos tipos de tejidos humanos, lo que posibilita un análisis espacial y cuantitativo detallado que supera a las técnicas tradicionales de IF.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Senescencia celular
- Imagen de inmunofluorescencia
- Patología digital
- Análisis de matriz de microtejidos
Antecedentes
- La imagen de IF tradicional tiene limitaciones en cuanto al número de marcadores que pueden evaluarse simultáneamente.
- La senescencia carece de un biomarcador universal; sus firmas varían según el tipo celular, el desencadenante y el tiempo transcurrido desde la inducción.
- La IF multiplex permite la detección de múltiples marcadores en una única sección de tejido, mejorando el perfilado de tipos celulares y estructuras.
- Las relaciones espaciales entre los tipos celulares y las estructuras del tejido son fundamentales para comprender la senescencia in situ.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para la tinción e imagen de inmunofluorescencia multiplexada en muestras de tejido humano.
- Permitir la detección imparcial y el análisis espacial de células senescentes mediante enfoques combinatorios de biomarcadores.
- Mostrar la utilidad de la imagen multiplexada para el perfilado completo del tejido.
Métodos Utilizados
- Se utilizaron matrices de microtejidos de 34 tipos de tejidos humanos.
- Tinción de inmunofluorescencia en 10 plex dirigida a biomarcadores estructurales, inmunitarios y de senescencia.
- Ciclos secuenciales de tinción, adquisición de imágenes e inactivación de colorantes para generar conjuntos de datos multiplexados.
- Adquisición de imágenes mediante un escáner de diapositivas con fluorescencia multiplex.
- Protocolos para la preparación manual y automatizada de diapositivas.
- Segmentación a nivel de célula individual y análisis espacial mediante software de patología digital.
Resultados principales
- Detección multiplex exitosa de múltiples biomarcadores dentro de secciones individuales de tejido.
- Evaluación de la abundancia y distribución espacial de células senescentes en diversos tejidos.
- Generación de conjuntos de datos multiplex de alto contenido adecuados para análisis espacial avanzado.
- Protocolos adaptables tanto para flujos de trabajo manuales como automatizados.
Conclusiones
- La IF multiplexada proporciona un enfoque potente e imparcial para la detección de células senescentes in situ.
- Los métodos descritos facilitan un análisis espacial y cuantitativo exhaustivo de muestras de tejidos.
- Este protocolo sirve como guía general para la obtención de imágenes multiplexadas en aplicaciones de investigación y patología.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La inmunofluorescencia multiplex permite el perfilado espacial de alto contenido de marcadores de senescencia en diversos tejidos humanos, abordando el desafío de las firmas heterogéneas de senescencia en el descubrimiento de fármacos. Este enfoque mejora la confianza predictiva en la validación de dianas y apoya la continuidad traslacional al permitir la evaluación simultánea de múltiples biomarcadores dentro de una única sección de tejido. El método está posicionado para mejorar la toma de decisiones en puntos críticos clave de las etapas iniciales del descubrimiento y en las líneas de investigación preclínica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite una interrogación exhaustiva de las vías asociadas a la senescencia mediante paneles combinatorios de biomarcadores.
- Apoya la reducción de riesgos biológicos al revelar firmas de senescencia específicas de tipo celular y de contexto.
- Facilita la confianza predictiva en la selección de dianas mediante el análisis espacialmente resuelto de marcadores.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara sistemas de tejidos validados para el cribado posterior de compuestos moduladores de la senescencia.
- Normaliza flujos de trabajo de ensayos multiplexados para la detección reproducible y cuantitativa de biomarcadores.
- Posibilita la obtención de imágenes y análisis escalables, adecuados para estudios de microarrays de tejidos de alto rendimiento.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Asocia datos espaciales de biomarcadores con contextos tisulares relevantes para la enfermedad, facilitando el desarrollo traslacional de biomarcadores.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la detección imparcial de células senescentes.
- Reduce los riesgos en las decisiones de avance al cuantificar la abundancia y distribución de células senescentes in situ.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este ensayo IF multiplexe se integra en el continuo de descubrimiento a preclínico al permitir un análisis cuantitativo con resolución espacial de marcadores de senescencia en microarreglos de tejido humano.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante el perfilado espacial de múltiples marcadores.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles para la evaluación de compuestos en contextos tisulares validados.
- Análisis: Ofrece conjuntos de datos de imágenes de alto contenido y resultados de patología digital para comparaciones estadísticas rigurosas.
- Investigación Traductiva: Conecta las fases de descubrimiento y preclínica al alinear datos de biomarcadores con tejidos relevantes para la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma escalable y adaptable para imágenes multiplexadas en diversos programas de I+D.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación sobre senescencia.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo de imágenes multiplexadas para garantizar la reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al permitir un análisis espacial robusto de biomarcadores.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de programas dirigidos a la senescencia.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en inmunofluorescencia multiplex y análisis de patología digital.
- Necesita acceso a escáneres de diapositivas multiplex y software de patología digital compatible.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de tinción, adquisición de imágenes y análisis.
- Adaptable a flujos de trabajo de preparación de diapositivas manuales y automatizados.
- Depende de la calidad del tejido y de la optimización del panel de marcadores para obtener resultados confiables.
