El análisis por inmunotransferencia

El inmunotransferencia, frecuentemente denominado transferencia Western, se utiliza para identificar en una muestra proteica las proteínas específicas reconocidas por anticuerpos policlonales o monoclonales. Este procedimiento suele seguir a una electroforesis en gel unidimensional o bidimensional y consiste en la transferencia de proteínas separadas a membranas de nitrocelulosa. La incubación de estas membranas con anticuerpos primarios y secundarios, conjugados directa o indirectamente a enzimas, y la visualización de antígenos proteicos en dichas membranas mediante reacciones con sustratos coloreados o fluorescentes.

En este video, ofrecemos una demostración paso a paso de un procedimiento de inmunotransferencia. Hola, soy Sean Gallagher de UVPI, colaborando con un centro proteómico aquí en el Instituto de Posgrado KE. Hoy les mostraré el análisis por inmunotransferencia.

Implica una serie de pasos, incluyendo la separación de proteínas, transferencia de las proteínas a membranas, inmunodetección y visualización con sustratos cromogénicos y quimioluminiscentes. Así que comencemos. Antes de iniciar el procedimiento de inmunotransferencia, las muestras de proteínas deben separarse primero mediante electroforesis utilizando geles unidimensionales o bidimensionales de tamaño pequeño o estándar.

Prepare las muestras antigénicas y colóquelas en los pozos del gel; incluya proteínas marcadas con prestaining o biotiniladas y patrones de peso molecular en una o más de las pistas del gel. Estos marcadores proteicos se transferirán a la membrana e indicarán convenientemente la orientación de la membrana y los tamaños de las proteínas tras la inmunotinción. Una vez completada la electroforesis, estamos listos para armar el inmunoblot.

Para armar el inmunotransferencia, primero desarme el sándwich del gel y retire el gel de apilamiento. Equilibre el gel durante 30 minutos a temperatura ambiente en tampón de transferencia; este equilibrio es necesario para evitar un cambio en el tamaño del gel durante la transferencia. Mientras el gel se está equilibrando, comience a armar el sándwich de transferencia en una bandeja lo suficientemente grande como para contener la caja de plástico para transferencia; llénela con tampón de transferencia hasta que la caja quede cubierta. Coloque ahora una almohadilla Scotch-Brite o una esponja en la mitad inferior de la caja de plástico para transferencia.

Luego tome una hoja de papel de filtro cortada al mismo tamaño que el gel. Humedézcala con tampón de transferencia y colóquela encima de la almohadilla Scotch Bright. Una vez finalizada la equilibración del gel de 30 minutos, coloque el gel encima del papel de filtro.

Elimine cualquier burbuja de aire entre el gel y el papel filtro pasando suavemente un tubo de ensayo o una varilla de vidrio sobre la superficie del gel. Alternativamente, puede usar el rodillo de BioRad, que viene con el kit de BioRad. Recuerde usar guantes al manipular papeles filtro, geles y membranas.

El aceite de sus manos bloqueará la transferencia. A continuación, prepare la membrana de transferencia. Corte la membrana al mismo tamaño que el gel, más uno o dos milímetros en cada borde.

Luego coloque la membrana en agua destilada lentamente con un borde en un ángulo de 45 grados; el agua ascenderá por capilaridad hacia la membrana y finalmente humedecerá toda la superficie. Si se inserta demasiado rápido en el agua, se atrapará aire y aparecerá como manchas blancas en la membrana. La proteína no se transferirá a estas áreas.

Una vez que la membrana esté completamente humedecida, equilíbrela durante 10 a 15 minutos en tampón de transferencia. Este procedimiento de humectación funciona para membranas de nitrocelulosa y nylon. Solo las membranas de PVDF son hidrofóbicas y no se humedecerán simplemente al colocarlas en agua destilada o tampón de transferencia.

Las membranas de PVDF deben sumergirse primero en metanol al 100 % durante uno o dos segundos, luego equilibrarse durante 10 a 15 minutos en tampón de transferencia. No permita que la membrana se seque en ningún momento.

Si esto ocurre, humedezca nuevamente con metanol y luego con el tampón de transferencia. Una vez que la membrana esté lista, coloque la membrana previamente humedecida directamente sobre la cara superior del gel. Recuerde eliminar todas las burbujas de aire entre el gel y la membrana rodando suavemente un tubo de ensayo, una varilla de vidrio o un rodillo de BioRad sobre la superficie de la membrana.

A continuación, humedezca otra pieza de papel de filtro Watman de 3 mm. Luego colóquela encima de la membrana y nuevamente elimine todas las burbujas de aire. A continuación, coloque otra almohadilla Scotch-Bright o esponja encima de este papel de filtro.

Complete el ensamblaje del sándwich de inmunotransferencia bloqueando la mitad superior de la caja de transferencia en su lugar. Ahora que el sándwich de inmunotransferencia está ensamblado, estamos listos para transferir las proteínas desde el gel a la membrana. Para comenzar el procedimiento de transferencia, llene el tanque de electrotransferencia con tampón de transferencia y coloque la caja de transferencia que contiene el sándwich dentro del aparato de electrotransferencia.

Es importante colocar el sándwich de manera que la membrana quede frente al ánodo o lado cargado positivamente del tanque. Conecte los cables de la fuente de alimentación a los lados correspondientes del ánodo y del cátodo del aparato de electrotransferencia. Este aparato de transferencia particular incluye un bloque de hielo para refrigeración.

Ahora, transfiera electroforéticamente las proteínas desde el gel a la membrana durante 30 a 60 minutos a 50 voltios con enfriamiento o durante la noche a 14 voltios en una cámara fría. Cuando finalice la transferencia, apague la fuente de alimentación y desarme el aparato. Luego, retire la membrana del equipo de transferencia y marque la orientación recortando una esquina.

En este momento, las membranas pueden secarse y almacenarse en una bolsa de plástico con cierre hermético a cuatro grados Celsius durante un año. Antes de cualquier procesamiento adicional, las membranas de PVDF secas deben colocarse en una pequeña cantidad de metanol al 100 % para humedecer la membrana. Luego, en agua destilada para eliminar el metanol.

Una vez marcada la orientación, tiña el gel para verificar la eficiencia de la transferencia. Para visualizar las proteínas transferidas, puede tiñar la membrana reversiblemente con rubí cipro o irreversiblemente con tinta india azul kamasi, azul de naftol u oro coloidal. Estos procedimientos de tinción irreversible son incompatibles con membranas de nailon.

Ahora que las proteínas se han transferido a la membrana, continúe con la detección inmunológica y visualización de las proteínas. En este paso, las proteínas inmovilizadas sobre la membrana se incuban con anticuerpos específicos para identificar y cuantificar cualquier antígeno presente. Para comenzar, coloque la membrana en una bandeja de incubación de plástico con 20 mililitros de tampón bloqueante.

Algunas personas utilizan bolsas, pero a menudo se prefieren las bandejas porque son especialmente útiles al procesar un gran número de tiras en diferentes soluciones de anticuerpos primarios. A continuación, incubar la membrana sellada durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente con agitación en un agitador orbital o plataforma basculante. Mientras la membrana está incubando, diluir el anticuerpo primario y el tampón de bloqueo.

La dilución se determina empíricamente, pero típicamente es de uno a 100 hasta uno a 1000. Para un anticuerpo policlonal, de uno a 10 hasta uno a 100 para sobrenadantes de hibridomas y mayor de uno a 1000 para líquido ascítico murino que contiene anticuerpos monoclonales. Una vez finalizada la incubación, deseche el tampón de bloqueo.

Sustituya el tampón por el anticuerpo primario diluido e incube nuevamente durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente con agitación constante. A continuación, lave la membrana cuatro veces agitando con 100 mililitros de TTBS para filtros de NITROCELULOSA o PVDF, o TBS para filtros de nailon.

Lave de 10 a 15 minutos cada vez; mientras se lava la membrana, diluya el anticuerpo secundario en el tampón de bloqueo. Ejemplos de anticuerpos secundarios incluyen peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina, conjugado anti IG, disponibles comercialmente como enzimas conjugadas. Los anticuerpos secundarios generalmente se diluyen de uno a 200 hasta uno a 25.000 antes de su uso.

Una vez finalizados los pasos de lavado y descartados los materiales de lavado, agregue peroxidasa de rábano picante diluida o fosfatasa alcalina, conjugado anti IG e incube de 30 a 60 minutos a temperatura ambiente con agitación constante. Después de 30 a 60 minutos, retire la membrana del recipiente y lávela cuatro veces, de 10 a 15 minutos cada vez, en TTBS como se describió anteriormente.

Una vez completados los lavados, estamos listos para proceder con el paso de visualización. Pero primero, demostraremos un procedimiento alternativo de inmunodetección. Este procedimiento alternativo de inmunodetección se basa en el kit de tinción ABC vectorial de Vector Labs.

Utiliza un complejo avidina-biotina para unir la peroxidasa de rábano picante o HRPO o fosfatasa alcalina AAP al anticuerpo secundario biotinilado. Hoy demostraremos el kit de HRPO. TTBS es adecuado como tampón de bloqueo para sistemas de avidina-biotina.

Pero para los filtros de nailon, se recomiendan los reactantes de unión a proteínas porque la leche descremada en polvo contiene biotina residual, que interferirá con el inmunoensayo. Debe usarse únicamente en el paso de bloqueo para comenzar a equilibrar la membrana en tampón de bloqueo en una bandeja abierta con agitación constante utilizando un agitador orbital o una plataforma oscilante. Incube la membrana durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente mientras la membrana se equilibra.

Prepare la solución de anticuerpo primario. Utilice TTBS para membranas de NITROCELULOSA o PVDF con sistemas de biotina de alta sensibilidad Aden.

La dilución de la cerilla que contiene el anticuerpo primario generalmente oscila entre uno en 1000 y uno en 100,000. El uso de química quimioluminiscente requiere el rango más alto de diluciones. En nuestro caso, se demuestra la detección cromogénica.

Estamos utilizando una dilución 1:5000 del anticuerpo primario. Una vez finalizada la equilibración, retire el tampón de bloqueo. A continuación, agregue suficiente solución de anticuerpo primario para cubrir la membrana.

Incube la membrana durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación suave después de 30 minutos. Lave la membrana tres veces en TTBS para nitrocelulosa a intervalos de cinco minutos. Durante el paso de lavado, prepare la solución de anticuerpo secundario biotinilado diluyendo una gota de anticuerpo biotinilado en 10 mililitros de TTBS. Una vez finalizados los pasos de lavado, agregue la solución de anticuerpo secundario.

Incube la membrana durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación lenta mientras se incuba con el anticuerpo secundario. Prepare la HRPO de biotina avadon para realizar esto. Mezcle dos gotas del reactivo A de tinción vti y dos gotas del reactivo B en 10 mililitros.

TTBS para nitrocelulosa. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente una vez finalizada la incubación con el anticuerpo secundario. Lavar la membrana tres veces a lo largo de 15 minutos con TTBS o TBS.

A continuación, agregue la solución enzimática de avidina biotina a la membrana e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación lenta. Luego lave la membrana tres veces a intervalos de 10 minutos con TTBS. Ahora que el procedimiento de inmunodetección ha finalizado, las proteínas unidas a la membrana están listas para ser visualizadas con sustratos cromogénicos.

Para este paso final de visualización, comúnmente se utilizan los sustratos CN-DAB/ICL-2 y TMB con procedimientos de inmunodetección basados en peroxidasa de rábano picante. Si el lavado final de la membrana durante el procedimiento de inmunodetección se realizó en TTBS, lave la membrana durante 15 minutos a temperatura ambiente con 50 mililitros de TBS. Ahora coloque la membrana en la solución cromogénica de visualización.

Las bandas proteicas deben aparecer entre 10 y 30 minutos. Después de la incubación de 30 minutos, deseche la mezcla de reacción del sustrato y detenga la reacción agregando agua destilada. La inmunodetección es un procedimiento de varios pasos utilizado por miles de laboratorios para detectar la presencia de proteínas específicas tras una electroforesis unidimensional o bidimensional.

Acabo de mostrarle cómo realizar un análisis inmunológico de sangre. Eso es todo. Buena suerte con sus experimentos y gracias por vernos.