En la diferenciación in vitro de la madre embrionarias de ratón (MES), las células con el método de gota

Las células madre tienen la notable capacidad de desarrollarse en muchos tipos diferentes de células en el cuerpo. Actúan como un sistema de reparación para el organismo. Teóricamente, pueden dividirse sin límite para renovar otras células.

Cuando una célula madre se divide, cada célula nueva tiene la posibilidad de permanecer como célula madre o convertirse en otro tipo de célula con una función más especializada. Esta prometedora área de la ciencia está llevando a los científicos a investigar la posibilidad de terapias basadas en células para tratar enfermedades in vitro. La diferenciación de células madre embrionarias ocurre cuando se permite que las células se agreguen en cultivo de suspensión.

En ausencia de fibroblastos embrionarios de ratón, células alimentadoras y factor inhibidor de la leucemia, estos agregados celulares se denominan cuerpos embrionarios. El método de la gota colgante es un procedimiento eficaz para la diferenciación de células madre en cuerpos embrionarios in vitro. Hola, soy Sha Juan, del laboratorio de la división de Medicina Cardiovascular de la Universidad de Stanford.

Hoy les mostraremos un procedimiento para la diferenciación individual de células madre embrionarias en cuerpos embriónicos utilizando el método de gotas manuales. Normalmente utilizamos este método para diferenciar células madre embrionarias en cardiomiocitos. Este procedimiento incluye los siguientes pasos: preparar una suspensión de células individuales de células madre embrionarias, generar cultivos de gotas manuales, transferir los cultivos de gotas manuales a placas de adherencia ultrabaja y sembrar los cuerpos embriónicos en placas recubiertas con gelatina.

Vale, comencemos. El primer paso del procedimiento consiste en preparar una suspensión simple de células de células madre embrionarias. Dado que cultivamos nuestras células madre embrionarias indiferenciadas haciendo que crezcan sobre fibroblastos embrionarios de ratón, debemos separar las células y aislarlas de los fibroblastos.

Para hacer esto, se realiza la tripsinización de las células utilizando procedimientos estándar. Una vez completado el tratamiento con tripsina, agregue medio de células madre embrionarias de ratón para neutralizar la tripsina. A continuación, transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros.

Luego, desintegre las colonias celulares pipeteando hacia arriba y hacia abajo contra el fondo del tubo hasta obtener una suspensión fina de células sin grumos visibles. Ahora, centrifugue las células a mil RPM durante cinco minutos. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y resuspenda las células con 10 mils de medio para células ES de ratón.

Transfiera la suspensión celular a un matraz T 75 previamente recubierto con gelatina al 0,1 % e incube a 37 grados con 5 %CO₂ durante una hora. Después de una hora, los fibroblastos se han adherido a la placa, pero las células madre permanecen en el medio. Aspire el medio para recolectar las células madre.

Centrifugar las células a mil RPM durante cinco minutos y aspirar el medio. A continuación, agregar otros 10 ml de medio de diferenciación y resuspender las células mediante pipeteo repetitivo hasta que parezca haber una suspensión fina de células. Contar las células utilizando un hemocitómetro.

Ahora estamos listos para cultivar la suspensión celular utilizando el método de gota colgante. Para iniciar el cultivo por gota colgante, use medio de diferenciación para diluir la suspensión de células madre hasta una concentración de 500 células por 20 microlitros. A continuación, invierta la tapa de una placa de cultivo de tejidos de 150 milímetros.

Luego, pipetee 20 microlitros de la suspensión celular sobre la superficie interna de la tapa de la placa. Utilizando una pipeta multicanal, agregue 10 ml de PBS a la placa. Invierta rápidamente la tapa de la placa y colóquela suavemente sobre la placa para formar las gotas colgantes.

Una vez que la tapa de la placa esté colocada, transfiera cuidadosamente la placa al cultivo en incubadora. Las células permanecen sin disturbios durante dos días. Una vez finalizada la incubación, procederemos a transferir el cultivo en gota colgante a placas de adherencia ultra baja.

Después de dos días, gire cuidadosamente la tapa de la placa y luego aspire 180 microlitros de medio de diferenciación fresco, y coloque varias gotas en una placa de 96 pocillos de adherencia ultrabaja. A continuación, recoja las gotas con una pipeta y transfiéralas una por una a la placa de 96 pocillos. Coloque las placas en el incubador sin moverlas durante tres días.

Los cuerpos embrionarios continuarán creciendo con forma esférica. Cuando la incubación esté completa, estaremos listos para sembrar los cuerpos embrionarios. Con el fin de ayudar a los cuerpos embrionarios a continuar diferenciándose.

Los transferimos a una placa de 48 pocillos recubiertos con gelatina. Para ello, primero recubrimos cada pocillo de la placa con 300 microlitros de gelatina al 0,1 %. Después de agregar la gelatina, incubar la placa durante la noche a 37 grados Celsius.

Al día siguiente, aspire la gelatina de la placa de 48 pocillos. Luego añada 300 microlitros de medio de diferenciación a cada uno. Ahora, transfiera uno por uno los cuerpos embrionarios de la placa de 96 pocillos a las placas de 48 pocillos recubiertas con gelatina.

Normalmente cambiamos el medio al día siguiente y luego cada dos días para mantener las células. Utilizamos este método para buscar mejores protocolos para la diferenciación de células madre embrionarias. En los cardiomiocitos, acabamos de mostrar cómo realizar la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón mediante cultivos en gotas colgantes.

Este método es eficaz porque el fondo redondeado de la gota colgante permite la agregación de células madre embrionarias, creando así un buen entorno para la formación de cuerpos embrionarios. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que la cantidad de células madre embrionarias que se agrupan en una gota colgante puede controlarse modificando el número de células en la suspensión celular inicial. Eso es todo.

Gracias por vernos. Buena suerte con su experimento.