La diferenciación eficiente de las células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras

El objetivo general de este procedimiento es diferenciar células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras. Primero, cultive células madre embrionarias de ratón sobre fibroblastos embrionarios primarios de ratón y suplemente con factor inhibidor de la leucemia. Luego, mejore el proceso de normalización mediante la adición de nogina, BFG F y FGF ocho; induzca la especificación de neuronas motoras mediante incubación con ácido retinoico y agonista de smoothened, seguido de alargamiento del axón y maduración de las neuronas motoras.

Finalmente, utilice microscopía de inmunofluorescencia para examinar células MES diferenciadas que expresan una fuerte fluorescencia GFP. La generación de grandes cantidades de neuronas motoras facilitó la investigación de enfermedades de las neuronas motoras en comparación con los protocolos actuales existentes. Este enfoque para diferenciar células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras es más eficiente. Este método puede proporcionar información sobre la atrofia muscular espinal.

También puede aplicarse a otras enfermedades de las neuronas motoras, como la esclerosis lateral amiotrófica. Para sembrar fibroblastos embrionarios primarios de ratón, recubra cuatro placas de cultivo de tejidos de 100 milímetros con ocho mililitros de solución de gelatina al 0,1%. Tras 30 minutos a temperatura ambiente, deseche el líquido en exceso. A continuación, diluya un vial de mitomicina C en PMEF activado en 40 mililitros de medio PMEF, siembre en las cuatro placas y cultive durante hasta una semana.

A continuación, descongele un vial de células MES en un baño de agua a 37 grados. Lave las células con cinco mililitros de medio E ES en un tubo de 15 mililitros. Después de centrifugar a 800 RPM durante cinco minutos.

Aspire el sobrenadante y re suspenda las células MES en 20 mililitros de medio ES con factor inhibidor de la leucemia recién añadido. Proceda a retirar 10 mililitros de medio de los cultivos PMEF y sustitúyalos por 10 mililitros de la suspensión de células ES HBG tres. Monitoree la progresión de las células MES a lo largo del tiempo, desde colonias pequeñas a las 24 horas hasta colonias de aproximadamente 100 micrómetros de diámetro a las 72 horas posteriores al siembra.

Cambie el medio diariamente para mantener la proliferación de las células para la inducción de células MES. Diferenciación en neuronas motoras. Las células madre embrionarias de ratón deben separarse primero de las células alimentadoras PMEF y luego cultivarse en un ambiente de suspensión el día de la inducción.

Para cada cultivo de ES de 100 milímetros, prepare un frasco T150 recubierto con gelatina al 0,1 %. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, retire la gelatina en exceso y lave tres veces con PBS. A continuación, aspire cuidadosamente el medio del cultivo de ES, asegurándose de no desalojar las colonias débilmente adheridas. Luego lave una vez con 10 mililitros de PBS.

Ahora, para separar las células MES de las PMEF, agregue tres mililitros de tripsina-EDTA al 0,25 % e incube durante tres a cinco minutos. A 37 grados Celsius, verifique que las células madre y las PMEF se hayan desprendido de la placa. Luego, agregue 15 mililitros de medio ES fresco e interrumpa las colonias mediante pipeteo.

Transfiera la suspensión celular al frasco T150 recubierto con gelatina preparado e incube durante 30 minutos a 37 grados Celsius para que las PFS se adhieran a la superficie gelatinizada. Ahora, recoja las células MES flotantes en un tubo de 50 mililitros y forme un pellet mediante centrifugación. Resuspenda las células en 10 mililitros de medio de diferenciación neural.

Contar el medio utilizando un hemocitómetro y luego sembrar en una placa de cultivo en suspensión de 100 milímetros para la diferenciación. Día uno, verificar mediante microscopía que las células MES hayan formado pequeños agregados flotantes denominados cuerpos embrionarios. Debido a cualquier contaminación con PMEF adherido a la placa, transferir las células en suspensión y el medio a un tubo de 15 mililitros y luego centrifugar a 500 RPM durante tres minutos.

Para cosechar los cuerpos embrionarios, aspire cuidadosamente el medio y agregue 10 mililitros de medio fresco de diferenciación neural a los EBC sedimentados, luego siembre las células en un nuevo cultivo en placa bacteriológica durante 24 horas en condiciones de diferenciación. Al segundo día, agite suavemente la placa de cultivo y transfiera el medio y los EBC a un tubo de 15 mililitros. Deje sedimentar los EBC por gravedad, aspire cuidadosamente el medio y resuspenda los EBC en 10 mililitros de medio de diferenciación a neuronas motoras.

Cultivar el medio EBS en un nuevo plato bacteriano durante cinco días en condiciones de diferenciación. En el día siete, verificar que los EBS tengan aproximadamente entre 150 y 200 micrómetros de diámetro y expresen señales fuertes de GFP en diferenciación. En el día cinco, dos días antes de disociar los EBS, colocar cubreobjetos redondos de 12 milímetros en el fondo de una placa de 24 pocillos.

Luego, agregue 0,5 mililitros de poli DL-ornitina al 100 microgramos por mililitro e incube a cuatro grados Celsius durante la noche. Aspire la poli DL-ornitina y seque al aire las placas y cubreobjetos en una cabina de cultivo celular. Enjuague los pocillos de la placa tres veces con agua doblemente destilada.

Deje secar al aire durante un tiempo para recubrir las laminillas. Prepare una dilución fresca de dos microgramos por mililitro de laminina de ratón en cinco mililitros de PBS 1X frío con hielo. Añada 0,5 mililitros por pocillo e incube a cuatro grados Celsius durante la noche.

Lave dos veces con PBS durante la diferenciación. En el día siete, recoja los EBS en un tubo de 15 mililitros y permita que los EBS sedimenten por gravedad. Después de cuatro lavados con PBS, agregue un mililitro de ACU max a los EBS, mezcle suavemente e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente, luego aspire el exceso de ACU max que cubre los EBS.

Ahora agregue tres mililitros de medio MND y disocie los EBS pipeteando aproximadamente 20 veces usando una micropipeta einor de un mililitro; luego incube durante dos minutos a temperatura ambiente y pase la suspensión celular a través de una tapa con filtro a un tubo de 12 por 75 milímetros. Repita este paso de disociación con los agregados restantes y las células retenidas por el filtro, con el fin de enriquecer el rendimiento de células individuales en una suspensión final de células individuales de seis mililitros. Mezcle suavemente la suspensión de células individuales y cuente las células utilizando un hemocitómetro; diluya las células en medio MND completo hasta una densidad de dos veces 10 a la quinta células por mililitro de placa.

0.5 mililitros de suspensión celular por pocillo de las placas de 24 pocillos preparadas que contienen cubreobjetos recubiertos con laminina y poli-DL-ornitina. Las células diferenciadas extienden largos neuritos después de dos días. En cultivo, HBG tres es una línea de células madre derivada de un ratón transgénico que expresa EGFP bajo el control de un promotor específico de motoneuronas HB nueve, con un protocolo de diferenciación definido.

Las células MES pueden utilizarse para derivar neuronas motoras. Las células MES indiferenciadas forman colonias redondeadas sobre una capa alimentadora de fibroblastos. Presentan una expresión débil de GFP.

Estas células MES se separaron de las capas de alimentación y se cultivaron en placas de baja adhesión para formar cuerpos embrionarios. Las células MES diferenciadas expresaron una fuerte fluorescencia GFP después del día siete. Los EBS de diferenciación se disociaron y sembraron en placas recubiertas con laminina poli DL ornitina.

Las células diferenciadas extienden largos neuritos desde los cuerpos celulares de las células sembradas después de dos días en cultivo; las neuronas motoras derivadas de células MES pueden caracterizarse mediante tinción de inmunofluorescencia. Estas células positivas para GFP expresan el marcador panneuronal neurofilamento y los dos marcadores específicos de neuronas motoras. Eyelid uno y colina acetil transferasa; la tinción DPI marca los núcleos, considerados en conjunto.

Nuestro protocolo de diferenciación en dos pasos proporciona un método eficiente para diferenciar células MES en neuronas motoras espinales. Después de ver este video, debería comprender cómo diferenciar eficientemente células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras. En conclusión, recuerde que la alta calidad de las células madre embrionarias de ratón es el parámetro más crítico para generar eficientemente neuronas motoras.