Méthodes électrophysiologiques pour l'enregistrement du potentiel synaptique de la JNM des larves de drosophile

Pour obtenir des enregistrements électrophysiologiques stables des jonctions neuromusculaires de larves de Joof, commencez par disséquer une larve afin d'exposer la paroi corporelle, les muscles et le système nerveux avant l'enregistrement. Les axones à la base du SNC sont sectionnés en arrière du ganglion ventral.

Ensuite, une électrode d'enregistrement est placée sur le muscle d'intérêt et une électrode de stimulation est positionnée près des motoneurones innervants. Les axones sectionnés des motoneurones sont aspirés dans la pipette de stimulation. Des potentiels jonctionnels excitateurs peuvent alors être enregistrés.

Bonjour, je suis Wendy MLA du laboratoire McCabe du département de physiologie et de biomécanique cellulaire de l'Université Columbia. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de mesurer la transmission synaptique au niveau de la jonction neuromusculaire de la larve de GE. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la physiologie synaptique et la neurotransmission.

Commençons donc. Pour démarrer l'expérience, disséquez des larves de troisième stade errantes et des larves star afin d'exposer la paroi corporelle. Ce protocole est modifié pour des expériences d'électrophysiologie en utilisant de courtes épingles de dissection.

Ils mesurent environ deux à quatre millimètres de longueur et ont moins de chances de heurter l'objectif du microscope ou les électrodes durant l'expérience. Après avoir exposé la paroi corporelle, utilisez une pince pour maintenir le SNC et le soulever légèrement. Ensuite, sectionnez les axones moteurs des nerfs périphériques et retirez le cerveau.

Après avoir retiré le cerveau, rincer deux fois la préparation dissectionnée avec du tampon HL 3.1 contenant un millimolaire de calcium. Maintenant que la dissection est terminée, des enregistrements intracellulaires peuvent être effectués sur les cellules musculaires larvaires. Placer la plaque de dissection sur le microscope d’électrophysiologie et immerger la préparation dans du tampon HL 3.1 additionné de calcium.

Fixez ensuite l'électrode de bain de manière à ce qu'elle soit en contact avec la solution. L'électrode de succion est utilisée pour stimuler les nerfs périphériques qui innervent le muscle. Placez d'abord l'électrode de succion dans la boîte afin d'éviter les vibrations lorsque l'électrode intracellulaire est positionnée sur le muscle.

Une fois l'électrode placée dans la boîte, positionnez-la près du motoneurone qui innerve le muscle six. Dans le troisième segment abdominal, appliquez une aspiration douce jusqu'à ce que le nerf sectionné soit à l'intérieur de la pipette en verre. Veillez à ne pas étirer les nerfs lors de l'application de l'aspiration.

Relevez légèrement la pipette afin qu'elle ne touche pas le muscle. Ensuite, positionnez-la de manière à ne pas tirer sur les fibres nerveuses sectionnées. Une fois l'électrode de succion en place, positionnez l'électrode d'enregistrement pour les enregistrements intracellulaires.

Utilisez une microélectrode fine remplie de chlorure de potassium à trois molarités. Placez l'électrode d'enregistrement au-dessus du centre du muscle six. Réglez le décalage d'entrée afin qu'il indique zéro pour la solution de bain.

Abaissez lentement l'électrode et approchez-vous du muscle sous forte amplification optique jusqu'à ce qu'elle touche la surface musculaire. Pour confirmer que le muscle a été pénétré, observez l'oscilloscope. Le potentiel de membrane au repos doit être d'au moins moins 60 millivolts.

Des potentiels post-synaptiques miniatures sporadiques devraient désormais être visibles. Une fois l'électrode d'enregistrement en place, laissez les cellules se stabiliser pendant une minute. Avant de commencer les enregistrements, utilisez un amplificateur Axon HS Two avec un étage d'entrée Head Stage dans un amplificateur Axclamp Two B pour détecter les changements du potentiel membranaire.

Le clamp de l'axe deux B est relié à un ordinateur qui exécute le logiciel P clamp via les données numériques du 1322 A, qui numérise le signal. Enregistrez le potentiel membranaire sur un PC. À l'aide du logiciel clamp X, appliquez des stimuli à l'axone moteur pour générer des potentiels membranaires excitateurs ou des ejs.

Une fois les EJP générés, enregistrez les EJP miniatures pendant une période de trois minutes sans stimulation synaptique. Le logiciel Soft Mini Analysis peut être utilisé pour analyser les tracés et déterminer l'amplitude et la fréquence des EJP miniatures. Pour générer les EJP.

Utilisez un générateur d'impulsions maître à huit impulsions pour stimuler l'extrémité sectionnée d'un programme de neurone moteur. Le générateur doit délivrer des impulsions de tension carrées de 0,3 milliseconde. Un intervalle de cinq secondes entre les stimuli permet la récupération synaptique.

Au niveau de la JNM, enregistrez au moins 10 potentiels évoqués à partir de chaque muscle et faites la moyenne des amplitudes. Cette figure montre un tracé typique enregistré sur le muscle six d'une larve de drosophile de type sauvage, avec des réponses EJP évoquées et des mini-EJP spontanés. Nous venons de vous montrer comment enregistrer des potentiels cy de la jonction neuromusculaire de la larve de drosophile. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de réaliser la dissection en trois à dix minutes maximum et de commencer immédiatement les enregistrements électrophysiologiques tant que les cellules sont encore saines et réactives.

Si la dissection prend trop de temps, le potentiel de membrane au repos des cellules musculaires sera inférieur à moins 60 millivolts, ce qui est trop faible pour être enregistré. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.