Channelrhodopsin2 stimulation médiée potentiels synaptiques au Drosophile Jonctions neuromusculaires

Cette procédure commence par l'élevage de drosophiles. Des larves de troisième stade portant le génotype approprié sont élevées sur un milieu contenant du rétinol tout-trans. Chaque larve est épinglée par la tête et la queue.

Ensuite, aplatir la préparation FLA. Le cerveau et les nerfs postérieurs sont alors sectionnés pour interrompre l'activité motrice rythmique. Ensuite, la source de lumière LED bleue avec son boîtier de commande est ajustée et focalisée sur la préparation.

Enfin, utilisez une électrode fine pour piquer le muscle numéro six. Ensuite, appliquez des impulsions lumineuses à l’aide d’une source de tension. Bonjour, je suis Nicholas Marstein du laboratoire de la Dre Leslie Griffith, du Département de biologie de l’Université Brandeis.

Bonjour, je suis Stefan Pulver, également du laboratoire Griffith. Aujourd'hui, nous allons vous montrer la procédure permettant d'induire des potentiels synaptiques à l'aide du mutant channelrhodopsin absent deux à la jonction neuromusculaire de la larve de drosophile. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la physiologie synaptique et la drosophile.

Nous l'utilisons également pour enseigner la physiologie synaptique et les travaux pratiques aux étudiants. Commençons donc. Pour commencer ce protocole, maintenez les lignées de drosophiles UAS channel redsin two et okay, 3 7, 1 gal four dans des bouteilles séparées contenant un milieu standard pour drosophiles.

Collectez des mouches vierges issues des lignées 3 7, 1 gal, quatre lignées de mouches, et des mâles issus des lignées UAS channel redsin. Deux lignées. Ensuite, préparez un milieu pour mouches mélangé à un millimolaire d'all-trans-rétinol ou de TR. Pour ce faire, faites fondre le milieu standard pour mouches au micro-ondes pendant environ une minute.

Une fois fondu, laissez refroidir le milieu pendant environ 30 à 60 secondes, puis ajoutez 100 microlitres de TR à 100 millimolaire dans de l'éthanol à 100 % pour chaque 10 millilitres de milieu pour mouches. Lorsque les flacons contenant le milieu à TR sont prêts, placez les mâles et femelles collectés dans chaque flacon. Placez les flacons dans un endroit sombre à une température de 22 à 25 degrés Celsius pour permettre aux mouches de s'accoupler et de pondre des œufs ; attendez quatre à cinq jours jusqu'à ce que des larves de troisième stade soient visibles.

À ce stade, vous pouvez éliminer les mouches adultes. Nous sommes maintenant prêts à procéder à la mise en place du dispositif d'électrophysiologie. Fixez un oculaire de loupe binoculaire à une source de lumière bleue LED équipée d'un dissipateur thermique.

Utilisez un support et une pince pour fixer une base magnétique à l'oculaire et à la source lumineuse LED. Placez la base magnétique sur la table anti-vibrations du dispositif d'électrophysiologie. Ensuite, reliez la source lumineuse à un circuit de commande, puis connectez le circuit de commande à une source de tension externe.

Nous utilisons la sortie de tension du système d'acquisition de données en électrophysiologie PowerLab fabriqué par AD Instruments. Une fois connecté à la source de tension, appliquez des impulsions d'un à cinq volts au circuit de commande afin d'activer la lumière bleue, puis ajustez la base magnétique et la source lumineuse jusqu'à ce que le faisceau de lumière bleue soit focalisé sur la zone qui accueillera la dissection larvaire. Après avoir effectué les réglages appropriés, nous sommes prêts à passer à la dissection larvaire.

Pour commencer la dissection, insérez six épingles de 0,1 millimètre dans le fond d'une boîte de Sögarh. Retirez des larves de troisième stade du milieu nutritif et placez-les dans une boîte de Petri en plastique. Rincez les larves avec du sérum physiologique afin d'éliminer tout résidu de nourriture adhérent aux larves.

Placez ensuite les larves dans la boîte de dissection près des épingles étirées et remplissez la boîte à moitié avec du sérum physiologique. Orientez maintenant les larves de manière à voir deux tubes argentés qui parcourent la surface dorsale de l'animal. Ces tubes argentés sont les trachées.

Insérez une grande épingle directement dans la queue, entre les tubes trachéens. Maintenez les larves vers le bas et placez une deuxième grande épingle dans leur tête. Veillez à étirer le corps dans le sens de la longueur lors de l'insertion de l'épingle.

Utilisez des ciseaux pour pratiquer une petite incision près de la queue. Poursuivez l'incision sur toute la longueur du corps. Veillez à garder les pointes des ciseaux relevées afin d'éviter de couper les nerfs ventraux et/ou les muscles de la paroi corporelle.

Placer quatre épingles aux quatre coins de l'animal. Ouvrir maintenant la région médiane. Insérer les épingles dans la boîte de dissection afin de désosser l'animal.

Épingler également la préparation afin de la maintenir tendue à l’aide de pinces et de ciseaux. Retirer les organes digestifs, la trachée et les corps gras de l’animal. Rincer la préparation avec du sérum physiologique.

Après le rinçage, repérez les lobes frontaux et le ganglion ventral de la préparation à l’aide de ciseaux microchirurgicaux. Coupez délicatement à travers le ganglion ventral juste derrière les lobes frontaux. Une fois la dissection terminée, procédez à la stimulation par lumière bleue et à l’enregistrement de l’activité musculaire.

Pour effectuer l'enregistrement musculaire, tirez une électrode ayant une résistance de 10 à 20 mégaohms. À l’aide d’un tireur d’électrodes électronique, remplissez l’électrode tirée avec du KCl 3 M. Placez l’électrode remplie dans le porte-électrode.

Placez maintenant la préparation larvaire sous un microscope stéréoscopique sur le dispositif. Ajustez la lumière bleue de manière à centrer la préparation disséquée dans le faisceau lumineux. Identifiez le muscle six ou M six dans n'importe quel segment de la paroi corporelle de la larve à l’aide d’un micromanipulateur, insérez délicatement l’électrode dans le muscle M six et observez une éventuelle hyperpolarisation rapide du muscle.

Les potentiels membranaires au repos doivent se situer entre moins 30 millivolts et moins 70 millivolts. Une fois que l'électrode est correctement insérée, appliquez des impulsions de tension de 20 à 100 millisecondes au circuit de commande. Augmentez progressivement la tension fournie au circuit de commande.

Surveillez la présence de potentiels de jonction excitateurs dans la cellule musculaire. Voici un résultat représentatif montrant un potentiel de jonction excitateur provoqué par de brèves impulsions lumineuses. L'amplitude du potentiel de jonction excitateur illustrée ici correspond à l'amplitude sommée de deux motoneurones, tous deux connus pour atter.

M six. Des intensités plus faibles ou des durées d'éclairement plus courtes peuvent révéler le potentiel jonctionnel excitateur de moindre amplitude provenant d'un seul motoneurone. Nous venons de vous montrer comment réaliser une stimulation, en l'absence de canal sodique, de potentiels synaptiques au niveau de la jonction neuromusculaire de l'oph.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas endommager la paroi corporelle de la préparation pendant la dissection. Il est également essentiel de garder à l'esprit que, bien qu'une préparation puisse être trop excitée juste après la dissection, elle se calmera avec le temps et permettra d'obtenir de bons enregistrements. Lors de l'impalation des muscles, faites attention à ne pas pénétrer au-delà de la première couche musculaire et dans la paroi corporelle.

Lorsque votre électrode est insérée dans la paroi corporelle, vous pouvez parfois obtenir des potentiels hyperpolarisés sans toutefois être à l'intérieur d'une cellule musculaire. Voilà tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.