Microinjection d'ARNm et oligonucléotides antisens morpholino dans embryons de poissons zèbres.

Cette procédure commence par la préparation de l'ARNm capé morpho et transcrit in vitro. Une micropipette est remplie par aspiration de la solution contenant le morpholino, puis le volume d'injection est calibré à l'aide d'un micromètre au stade unidéveloppementnel. Des embryons de poisson zèbre sont ensuite collectés et disposés dans une chambre de microinjection pour des injections intrayolques.

La solution de travail est injectée dans le vitellus juste sous la cellule, et les mouvements cytoplasmiques servent à transporter la solution pour les micro-injections cellulaires. Injecter la solution dans le cytoplasme cellulaire après les injections. Incuber les embryons à 28,5 degrés Celsius dans le milieu E3 et analyser les phénotypes d'intérêt aux stades ultérieurs.

Bonjour, je suis Shiloh Yuen du laboratoire, le fils du Dr. Sasha et du Département de génétique de la faculté de médecine de l'Université Yale. Aujourd'hui, nous allons démontrer une technique solide de microinjection permettant d'effectuer des études d'hyperexpression d'ARNm et d'inhibition génique par oligonucléotides morpholinos chez le poisson-zèbre. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le rôle du cil S dans les maladies rénales kystiques.

Commençons. Une approche puissante pour l'étude de la fonction des gènes consiste à micro-injecter de l'ARN capé transcrit in vitro dans des embryons de poisson zèbre. Dans cette démonstration, nous allons micro-injecter un ARN marqué par la EGFP et utiliser l'expression de la GFP dans l'embryon entier en temps réel comme indicateur visible d'une injection réussie.

Tout d'abord, nous effectuerons une réaction de transcription in vitro d'ARN coiffé pour votre transcrit d'intérêt. Dans notre laboratoire, nous insérons couramment l'ADNc d'intérêt dans un vecteur PCRII-TOPO et réalisons une réaction de synthèse in vitro afin d'obtenir de grandes quantités d'ARN coiffé à l'aide du kit Mmessage Mmachine SP6. Ensuite, nous purifierons l'échantillon d'ARN en utilisant le kit RNeasy Mini ou par extraction au phénol-chloroforme suivie d'une précipitation à l'isopropanol.

Déterminez soigneusement la concentration de la préparation d'ARN et conservez-la à moins 80 degrés Celsius jusqu'au jour de l'injection. Décongelez l'échantillon d'ARN, vortexez-le légèrement puis centrifugez-le brièvement. Préparez maintenant une solution de travail avec de l'eau stérile et une concentration finale de 0,025 à 0,05 % de rouge de phénol ; le rouge de phénol sert de marqueur visible pour l'injection de la solution dans l'embryon.

Ici, nous préparerons une solution de travail d'ARNm EGFP à 100 nanogrammes par microlitre avec 0,05 % de rouge de phénol. Enfin, gardez l'échantillon de travail sur de la glace et remettez la solution mère d'ARN à moins 80 degrés Celsius. Passez à la préparation du morpho lorsque vous êtes prêt à injecter cet échantillon.

Les oligonucléotides antisens morino sont largement utilisés pour modifier l'expression génique en bloquant la traduction d'une protéine ciblée ou en modifiant l'épissage de l'ARN pré-messager. Les morpholinos chez le poisson zèbre constituent un outil puissant de génétique inverse en permettant l'inhibition de la fonction d'un gène. Ici, nous allons micro-injecter un oligomorpholino ciblant le site d'initiation de la traduction de pkd2. Nous utilisons couramment 300 M d'un oligomorpholino spécifiquement conçu pour un gène d'intérêt, obtenu auprès de Gene Tools LLC.

Nous ajoutons ensuite 100 microlitres d'eau stérile pour obtenir une solution mère à trois millimolaire, puis nous aliquotons la solution et la conservons à moins 20 degrés Celsius jusqu'au jour de l'injection. Nous chauffons la solution morino à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, nous refroidissons rapidement la solution sur de la glace immédiatement, puis nous effectuons une brève centrifugation ; cette étape dénature toutes les structures secondaires de l'oligo et garantit que la solution est complètement solubilisée.

Ensuite, nous préparerons une solution de travail en diluant la solution Morpho dans de l'eau stérile pour obtenir une concentration finale de 0,025 à 0,05 % de rouge de phénol. Dans cette démonstration, nous préparerons une solution de travail de 0,5 millimolaire de PKD deux morino avec 0,05 % de rouge de phénol. Conservez la solution de travail à température ambiante et passez au remplissage de la micropipette lorsque vous êtes prêt à injecter cet échantillon.

Pour commencer, nous devons fabriquer des micropipettes destinées aux injections. Cela se fait en chauffant et en tirant des tubes capillaires en verre silicaté BOS dans un appareil de tirage de micropipettes. Une fois les aiguilles tirées, elles sont conservées dans une boîte de Pétri, posées sur une petite quantité d'argile ou de ruban adhésif.

Ensuite, nous préparerons des plaques de chambre de microinjection en versant du milieu 1,5 % d'aros dans des plaques XE trois, moulues avec des rigoles en forme de coin. Cela servira de méthode simple pour maintenir les embryons pendant l'injection. Les plaques de chambre d'agar sont ensuite laissées à durcir et conservées à quatre degrés Celsius jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à être utilisées.

Pour commencer à remplir la micropipette, coupez la pointe distale à l’aide de pinces ou d’un scalpel chirurgical afin de créer une ouverture juste visible au microscope stéréoscopique à un grossissement de 50 x. Ensuite, déposez deux microlitres de votre solution de travail.

Comme une goutte sur un lamelle, fixez l'extrémité arrière d'une micropipette à une seringue de cinq millilitres équipée d'un tube sur une aiguille hypodermique et immergez légèrement l'extrémité distale de la micropipette dans votre goutte de solution de travail. Veillez à ne pas casser l'embout de la micropipette. Aspirez la solution de travail par l'extrémité distale de la micropipette en tirant sur le piston de la seringue.

Ensuite, nous allons étalonner le volume d'injection de la micropipette. Déposez une goutte d'huile minérale sur une lame micrométrique et allumez l'alimentation électrique et l'arrivée d'air de l'appareil d'injection micro-pulsée sous pression. Puis, fixez la micropipette au porte-micropipette de l'appareil d'injection micro-pulsée.

L'injecteur micro est régulé par pression et les décharges sont activées en appuyant sur la pédale avec le pied sous le microscope stéréo. Testez le volume d'injection en utilisant l'injecteur micro pour déposer une goutte de votre solution de travail sur l'huile du micromètre. Mesurez le diamètre de la goutte lorsqu'elle flotte sous forme de sphère à la surface de l'huile.

Ajustez la durée et la pression de l'injection afin de calibrer précisément le volume injecté. Cette étape facilite la reproductibilité de l'expérience de microinjection. Dans cette démonstration, toutes les microinjections seront effectuées avec un diamètre de goutte de 0,15 millimètre.

Enfin, une fois le volume d'injection calibré, utilisez le bouton de maintien sur le micro-injecteur pour éviter le remplissage rétrograde et les fuites de la micropipette. Il est maintenant temps de préparer les embryons de poisson zèbre. Les poissons zèbres s'accouplent aléatoirement durant les premières heures de chaque matinée ; pour commencer la préparation, récupérez les embryons au stade une cellule et placez-les dans un milieu 1 XE3.

À l’aide d’une pipette de transfert de trois millilitres, disposer les embryons le long des rainures en forme de coin sur les plaques de la chambre de microinjection. Retirer le milieu afin que les embryons soient faiblement immergés et non submergés. Cette étape facilite le dépôt des embryons au fond des rainures ainsi que la pénétration du chorion par la micropipette.

Nous allons maintenant commencer les injections. Tout d'abord, manipulez les embryons à l’aide de la micropipette afin que le cytoplasme de l’embryon au stade une cellule soit visible sous le microscope stéréoscopique. Veillez à ne pas casser l’extrémité de la micropipette ; pénétrez la corona puis le vitellus avec la micropipette afin d’injecter dans l’embryon.

Dans cette démonstration, nous allons d'abord effectuer une microinjection dans le vitellus directement sous la cellule, en laissant le cytoplasme et la diffusion acheminer la solution de travail dans la cellule. Ce flux est visible grâce au rouge de phénol ajouté à la solution de travail. Étant donné qu'il s'agit d'un embryon unicellulaire, il peut être injecté à la main ou à l'aide d'un manipulateur.

Nous allons également démontrer l'injection directe dans le cytoplasme de la cellule. La microinjection directe dans la cellule est plus robuste, mais elle est chronophage, car elle nécessite une orientation adéquate de l'embryon et une technique de microinjection précise. Étant donné que la membrane cellulaire est plus rigoureuse que la membrane du vitellus, il est souvent plus rapide de faire pénétrer la micropipette à travers le vitellus pour atteindre la cellule.

L'orientation du cytoplasme en plaçant le pôle animal vers le bas de la rigole, combinée à des mains stables, peut faciliter cette méthode d'injection. Après la microinjection, placer les embryons dans une boîte de Pétri contenant le milieu E3 et les incuber à 28,5 degrés Celsius pour un développement normal. Au cours des heures et jours suivants le développement embryonnaire, observer les embryons pour détecter les phénotypes d'intérêt.

Pour vérifier la réussite de la microinjection, nous allons surveiller l'expression de la GFP dans les embryons en développement à partir du stade bouclier, à l'aide d'une microscopie par fluorescence in vivo sur l'embryon entier. L'expression du construit est la plus forte lors des premiers événements du développement embryonnaire et s'atténue souvent au cours du développement, car l'ARN coiffé injecté est progressivement dégradé et dépend de la stabilité de la protéine exprimée. D'après des résultats publiés précédemment, nous nous attendons à ce que la morphine PKD deux imite la courbure de l'axe corporel dorsal observée chez les zebrafish mutants PKD deux, et présente des kystes rénaux environ deux à trois jours après la fécondation.

Nous venons de vous montrer une technique solide de microinjection permettant d'effectuer des études d'hyperexpression d'ARNm et d'inhibition génique par oligonucléotides morpholinos chez le poisson zèbre. Lorsque vous réalisez cette procédure, souvenez-vous qu'il est important d'injecter d'une main ferme. Voilà tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.