Micromanipulation de l'expression génique dans le cerveau de poisson zèbre adulte en utilisant microinjection Cerebroventricular d'oligonucléotides Morpholino

L’objectif global de cette procédure est de micro-injecter des oligonucléotides morphes dans le ventricule cérébral du cerveau du poisson-zèbre adulte et de réduire l’activité des gènes dans les cellules radiogliales. Ceci est accompli en anesthésant d’abord le poisson zèbre. Ensuite, une fente est générée dans le crâne, recouvrant le tum optique à l’aide d’une aiguille dentée barbelée.

Ensuite, la solution morpho est injectée par le site d’incision dans le liquide ventriculaire cérébral. Enfin, l’efficacité et la précision de l’injection sont vérifiées au microscope à fluorescence. En fin de compte, on peut obtenir des résultats sur le blocage trop efficace et généralisé de la production de protéines à partir des gènes d’intérêt dans les cellules gliales radiales du cerveau du poisson-zèbre adulte par l’inactivation de gènes médiée par morpho, qui peut être dosée par des coupes histologiques et des colorations immunohistochimiques.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme les approches transgéniques ou les méthodes d’administration basées sur l’électro-opération, est que l’ICVV prend moins de temps et est plus efficace pour cibler l’ensemble de la population de cellules radiogliales. Ces gènes ajustables et de nombreux peuvent être renversés en même temps. Pour préparer le mélange d’injection, commencez par préparer une solution mère de Morpho 500 micromolaires.

En utilisant du PBS pour 10 injections, préparez 10 microlitres de mélange d’injection en combinant neuf microlitres de solution morpho diluée ou non diluée avec un microlitre d’un colorant fluorescent. Conservez-le à température ambiante. À l’aide d’un extracteur d’aiguille, préparer les capillaires d’injection de verre selon les paramètres suivants.

Allumez la source de pression et ajustez les paramètres de pression à 50 PSI ou 3,5 bars. Ajustez les paramètres du micro-injecteur comme suit. Pression de maintien 20 PSI, pression d’éjection 10, valeur de période PSI, 2,5 et 100 millisecondes.

Portée du gating. Allumez l’illuminateur annulaire et localisez l’anneau au-dessus de la platine du microscope. Placez le support capillaire à un endroit approprié à côté du microscope.

Insérez le capillaire en verre dans le support et ajustez l’angle d’injection à 45 degrés. À l’aide d’une pince d’extrémité, cassez l’extrémité du capillaire en verre et calibrez la pression de sortie de l’orifice. En immergeant la pointe de l’aiguille dans l’eau du poisson et en appliquant une impulsion de pression continue, les bulles d’air doivent former une seule rangée indiquant la pression optimale ou la taille de l’orifice.

Chargez le capillaire en verre avec la solution d’injection. En évitant les bulles d’air, appliquez une pression pour évacuer l’air entre l’extrémité du capillaire en verre et la solution d’injection chargée. Après avoir préparé une solution de tige à 0,1 % de l’anesthésique, transférez le nombre désiré de poissons dans un récipient de transport avec de l’eau de poisson.

Préparez une solution d’anesthésique fonctionnelle en mélangeant 200 millilitres d’eau de poisson avec cinq millilitres de solution mère MISP. Remplissez une boîte de Pétri à moitié avec l’anesthésique à utiliser pour les injections. Incuber un poisson dans l’anesthésique jusqu’à ce qu’il cesse de bouger.

Ensuite, utilisez un filet pour le transférer dans la boîte de Pétri de l’anesthésique. Pour faciliter l’incision, utilisez la pince pour tenir doucement le poisson et orientez-le avec la tête légèrement inclinée vers le bas. À l’aide de la pointe d’une aiguille barbelée de calibre 30, faites une petite fente sur le crâne sans pénétrer trop profondément car cela causerait des dommages au tissu cérébral.

Tout en continuant à tenir le poisson, insérez la pointe du capillaire en verre à travers le site d’incision d’environ un demi-millimètre, et tout en évitant le contact avec le tissu cérébral, orientez-le vers le céphalon. Injectez la solution, elle doit se disperser immédiatement. Transférez le poisson dans de l’eau fraîche de poisson et laissez-le récupérer.

Environ 30 minutes plus tard, anesthésie à nouveau le poisson et vérifie-le au microscope à fluorescence pour rechercher une distribution généralisée du liquide. Basé sur la fluorescence rouge. Remettez le poisson dans son aquarium et remettez-le en circulation.

Jusqu’à l’utilisation pour des analyses comportementales ou pour la préparation d’échantillons de tissus, comme on le voit ici, une injection précise conduit à la dispersion de la solution injectée dans tout le cerveau et au ciblage efficace des cellules proches de la surface ventriculaire. Cependant, les injections où le capillaire de verre s’empale, le tissu cérébral aura un signal fluorescent dense au point d’injection. Et si la quantité injectée n’est pas suffisante, un faible signal fluorescent sera observé.

Cette figure démontre que vivo morphos peut pénétrer quelques diamètres cellulaires à l’intérieur de la surface ventriculaire, et peut donc cibler efficacement les cellules ventriculaires par rapport au contrôle. Morpho. L’injection de morpho contre le PCNA réduit efficacement l’expression des gènes dans les cellules ventriculaires. Dans ces images d’immunofluorescence, l’immunocoloration BRDU et QCD après l’expérience de poursuite d’impulsions A-B-R-D-U démontre que l’inhibition du PCNA avec des morphoses antisens entraîne une réduction significative des neurones nouveau-nés, suggérant que CVMI peut être utilisé pour éliminer des gènes endogènes qui donnent ensuite lieu à des conséquences fonctionnelles.

Ainsi, après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer les mécanismes moléculaires impliqués dans la réponse de neurogenèse régénératrice du S adulte du cerveau du poisson.