Antigène spécifique de CD4 + Visualisation cellules T à l'aide du CMH de classe II tétramères

Bon, ce qui est vraiment unique dans le test Teer, c'est qu'il vous permet de visualiser directement les lymphocytes T spécifiques de l'antigène. Le te, le Teer constitue l'aspect principal et unique de notre test. Cela est associé à une étape d'amplification que nous réalisons.

Vous savez, nous isolons les lymphocytes T, puis nous les cultivons dans un environnement qui enrichit l'échantillon en lymphocytes T qui nous intéressent. Ensuite, nous sommes en mesure d'étiqueter spécifiquement uniquement ces cellules et de les visualiser sur un cytomètre en flux. Or, avec les dosages antérieurs, comme les dosages à base de CSFE ou les dosages de prolifération utilisés depuis des décennies, ce que l'on obtient correspond à des mesures globales d'ensemble sur l'activité de la population totale de lymphocytes T.

Mais vous avez des millions de cellules T dans l'organisme, et elles reconnaissent un ensemble très diversifié de motifs. Si vous avez de la chance, peut-être une cellule sur deux à trois cent mille dans l'échantillon sera celle que vous recherchez. C'est pourquoi cet essai inclut des étapes d'enrichissement.

Ensuite, avec un numéro de test, et parce que vous réalisez une coloration directe, vous pouvez effectivement visualiser, au-delà du bruit de fond, une population représentant moins de 1 % du nombre total de cellules. Ainsi, vous pouvez observer des différences très, très faibles et obtenir un décompte assez précis du nombre de lymphocytes T présents dans cet échantillon sanguin, c’est-à-dire chez cet individu, qui reconnaissent votre motif d’intérêt. Mais cela ne s’arrête pas là, car les tétramères vous permettent non seulement d’étiqueter ces lymphocytes T, mais également de les isoler pour des analyses ultérieures.

Et les tétramères que vous utilisez sont en réalité fabriqués ici au BRI, est-ce exact ? Oui. Nous sommes l'un des très rares laboratoires du pays à avoir réussi la production de tétramères de classe II. Notre objectif est de distribuer ces réactifs à prix coûtant à tous les laboratoires intéressés par l'adoption de cette technologie.

Quels sont, selon vous, les aspects les plus difficiles ou les plus délicats de ce dosage lorsqu'il s'agit de le reproduire dans d'autres laboratoires ? Eh bien, en y réfléchissant, il y en a vraiment deux : la culture des lymphocytes T. C'est quelque chose qui relève un peu de l'art.

Vous avez presque quotidiennement des décisions à prendre concernant la nécessité d'apporter des nutriments supplémentaires ou un espace accru à la culture cellulaire. Ensuite, la deuxième partie, que je pense être probablement la plus difficile pour un opérateur inexpérimenté, concerne l'analyse des données. Il s'agit essentiellement de déterminer quelle partie du signal correspond réellement à une réponse positive, par opposition à celle qui est simplement inhérente, disons, aux phénomènes physiques et à l'attraction.

Et le fait que tout possède un certain degré d'adhérence est une notion qui, là encore, nécessite beaucoup d'expérience, particulièrement dans des contextes où la réponse globale sera un peu faible. En quoi les informations que vous obtiendrez avec ce test pourraient-elles bénéficier aux patients à ce stade ? L'un des premiers signes caractéristiques observés chez tout patient atteint d'une maladie auto-immune est une constellation d'anticorps spécifiques à cette maladie.

Nous savons, d'après les principes fondamentaux de l'immunologie, que chaque réponse anticorps est toujours précédée par une réponse des cellules T. Ainsi, si nous pouvions examiner des individus à risque et observer cette augmentation de l'activité des cellules T qui précède la formation d'anticorps, cela nous permettrait de définir un nouveau niveau de risque, indiquant que ces individus sont en voie de développer des autoanticorps. Cela ouvrirait alors une fenêtre d'opportunité pour des thérapies préventives. Cette procédure permettra de purifier et d'agrandir les cellules T CD4 positives spécifiques de l'antigène, puis de les visualiser à l'aide de réactifs tétramères et d'équipements, notamment des hottes de sécurité biologique de classe II à flux laminaire.

Ce sera l'espace de travail principal pour la procédure. Des tubes coniques de 50 millilitres, un tube principal pour l'isolement des PBMC, un XPBS. Celui-ci doit être sans calcium ni magnésium, conditionné dans un emballage folio et enveloppé de papier d'aluminium pour le protéger de la lumière, une pipette assistée, une pipette CoStar de 10 mil, des embouts aérosols avec des inserts de 50 mil utilisés pour prévenir la contamination du centrifugeuse par le sang.

Pipettes de transfert pour centrifugeuse GS six R, pipettes Pasteur, tampon hémolytique contenant 8,3 grammes par litre de chlorure d'ammonium, 1,0 gramme par litre de bicarbonate de sodium, 0,04 gramme par litre de DI sodium EDTA, solution de trian bleu à 0,2 % dans du PBS, hémocytomètre, tube conique de 15 millilitres, tampon de lavage contenant du PBS supplémenté avec 2 millimolaire d'EDTA plus 5 grammes par litre.

Kit d'isolement BSA max CD quatre deux acheté chez Milin Biotech, bloc magnétique EP acheté chez Stem Cell Technologies. D'autres plates-formes d'enrichissement cellulaire magnétiques pourraient être utilisées avec une efficacité équivalente. Tube en polypropylène de cinq millilitres, RPMI 1640 supplémenté avec 25 millimolaire de HEPES utilisé pour préparer le milieu pour lymphocytes T, sérum humain poolé utilisé pour supplémenter le milieu pour lymphocytes T, bande de pénicilline-streptomycine utilisée pour supplémenter le milieu pour lymphocytes T, filtre stérile de 500 millilitres à 0,22 micron avec bouchon pour flacon, plaque stérile de 48 puits utilisée pour la culture d'expansion in vitro, étape dans une étuve à CO2 à 37 degrés, solution de 20 milligrammes par millilitre de peptide synthétique contenant l'épitope d'intérêt.

Tube en polystyrène de 5 ml chargé en peptide de classe II tétramère utilisé pour visualiser les lymphocytes T spécifiques de l'antigène, anticorps anti-CD3, anti-CD4 et anti-CD25 utilisés pour revêtir les lymphocytes T spécifiques de l'antigène. Cytomètre de flux Fax Caliber ou équivalent avant de commencer la procédure. Rassemblez tous les matériaux et équipements dans votre espace de travail.

La démonstration suivante couvrira les étapes suivantes : isolement des PBMC, séparation des lymphocytes T CD4 positifs, culture d'expansion in vitro, visualisation des lymphocytes T par microscopie ou coloration. Étape un : isolement des PBMC.

Prélevez un échantillon de sang. Le sang doit être recueilli dans des seringues ou des tubes à sang et anticoagulé avec de l'héparine selon un rapport de un à cinquante pour prévenir la coagulation ; prévoyez un rendement d'environ 1 million de PBMC par millilitre de sang. Environ 40 % de ceux-ci seront des lymphocytes T positifs pour le CD4.

Prélevez des aliquotes de sang dans des tubes coniques de 50 millilitres. Ajoutez 25 millilitres de sang par tube. Mélangez doucement le sang avant la formation du caillot ALI afin de répartir le plasma.

Ajouter du PBS pour porter le volume total à 40 millilitres et superposer en séchant 11 millilitres de flacon inséré dans un tube à sang, puis retirer soigneusement l'embout de pipette de la pipette. Le flacon s'écoulera lentement vers le fond du tube. Une fois le niveau égalisé, retirer lentement la pipette du tube à sang, boucher les tubes à sang et les transférer dans l'aérosol des bonbonnes.

Fermez fermement les godets et centrifugez à 900 fois G pendant 20 minutes sans frein. Il est essentiel de ne pas appliquer de frein à la fin de cette centrifugation, car la force de freinage perturberait la couche de cellules après la rotation. Les PBMC doivent former une couche blanche bien distincte entre le plasma jaune situé au-dessus et le fiel transparent situé en dessous.

Prélève délicatement la couche de cellules sanguines blanches à l’aide d’une pipette de transfert et transfère-la dans un nouveau tube. Un peu de plasma et de fial peuvent être aspirés avec les PBMC, mais évite d’aspirer la couche de globules rouges. Généralement, deux tubes de sang peuvent être combinés en un seul tube à cellules à cette étape.

Pour augmenter la taille du culot, ajouter du PBS jusqu'à un volume total de 15 millilitres et centrifuger à 500 ×g pendant 15 minutes avec une décélération faible, puis aspirer le liquide des cylindres à l’aide d’une pipette Pasteur, en prenant soin de ne pas perturber le culot. Traiter avec un tampon hémolytique en ajoutant cinq à six millilitres dans chaque tube et en mélangeant doucement pour éliminer les agrégats. Incuber pendant un maximum de cinq minutes.

Ajouter du PBS pour amener le volume total à 50 millilitres et centrifuger à 230 ×g pendant 10 minutes. Pour ces rotations plus lentes, les aérosols à faible freinage ne sont plus nécessaires. Laver deux fois : aspirer le liquide à l’aide d’une pipette Pasteur, remplir le tube avec du PBS et centrifuger à 230 ×g pendant 10 minutes. Avant la dernière étape de lavage, prélever un aliquot de cellules resuspendues, diluer avec du bleu de trypan et dénombrer à l’aide d’un hémocytomètre.

Le nombre de cellules déterminera les volumes de réactif utilisés lors de la séparation des lymphocytes T. Deuxième étape, séparation des lymphocytes T CD4 positifs, aspirez le liquide et ajoutez du tampon de migration pour porter le volume total à 40 microlitres par 10 millions de cellules. Généralement, cela nécessite 30 microlitres de tampon plus le volume résiduel du culot.

Transférez ce volume dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez le cocktail d'anticorps provenant des kits d'isolement CD4, soit 10 microlitres par 10 millions de cellules, et placez le tube sur de la glace pendant 10 minutes. Retirez le tube de la glace, ôtez le bouchon et ajoutez 30 microlitres de tampon de migration par 10 millions de cellules.

Ajouter les billes magnétiques du kit d'isolement CD4. 20 microlitres par tube de 10 millions de cellules et placer sur de la glace pendant 15 minutes. Ajouter 10 volumes de tampon de lavage et centrifuger à 230 ×g pendant 10 minutes.

Pendant la centrifugation, préparez l'aimant et un tube en polypropylène de cinq millilitres dans votre espace de travail. Aspirez le liquide du culot cellulaire. Ajoutez deux millilitres de tampon de lavage et éliminez les agrégats à l’aide d’une pipette de transfert.

À l’aide de la même pipette de transfert, transférez les cellules dans le tube de cinq millilitres et incubez dans l’aimant pendant 15 minutes. Versez soigneusement la fraction de lymphocytes T CD4 positifs dans un tube de 15 ml marqué en retournant l’aimant, en vidant tout sauf la dernière goutte. Ajoutez deux millilitres supplémentaires de tampon de lavage dans le tube de cinq millilitres, puis retirez-le de l’aimant.

Rincez doucement la disquette quatre cellules négatives des parois du tube et transférez-les dans un tube de 15 ml marqué. Ajoutez deux millilitres de milieu pour lymphocytes T dans chaque tube. Prélevez des aliquots pour le décompte cellulaire et centrifugez à 230 ×g pendant 10 minutes.

Effectuez une dilution des aliquotes cellulaires avec du bleu de trypan et comptez à l’aide d’un cytomètre hématologique. Ces dénombrements cellulaires détermineront le nombre de puits utilisés pour la culture d’expansion. Étape trois.

Prélevez par aspiration le liquide de la culture d'expansion in vitro à partir des culots cellulaires CD4 positifs et CD4 négatifs, en fonction du nombre de cellules. Ajoutez du milieu aux cellules CD4 positives pour ajuster le volume à 3 millions de cellules par millilitre. Ajoutez du milieu aux cellules CD4 négatives pour ajuster le volume à 10 millions de cellules par millilitre.

La culture d'expansion nécessite 3 millions de cellules CD quatre négatives par puits et deux à 3 millions de cellules CD quatre positives par puits. Généralement, les cellules CD quatre positives constituent la population limitante. Répartir par aliquots les cellules CD quatre négatives dans le nombre approprié de puits d'une plaque de 48 puits.

En ajoutant 300 microlitres à chaque puits, placer la plaque dans un incubateur à 37 degrés pendant une heure. Retirer la plaque de l'incubateur, laver les puits en ajoutant 500 microlitres de milieu frais et en pipetant doucement 12 à 20 fois vers le haut et vers le bas à l’aide d’une pipette de transfert, puis en éliminant tout le liquide. Ce lavage laissera une couche de cellules présentatrices d’antigènes adhérentes.

Lorsque le lavage est terminé, ajoutez suffisamment de milieu pour humidifier le fond de chaque puits, environ 100 microlitres. Sinon, les cellules adhérentes sécheront. Ajoutez deux à trois millions de cellules CD4 positives dans chaque puits si nécessaire.

Ajoutez du milieu supplémentaire pour porter le volume total dans chaque puits à un millilitre. Ajoutez le peptide souhaité à chaque puits. La concentration typique pour la stimulation est de 10 microgrammes par millilitre.

Placer finalement la plaque dans une étuve à 37 degrés pendant sept jours. Après sept jours, ajouter 50 microlitres de hemo IL deux à chaque puits chaque jour suivant.

Surveiller la croissance cellulaire à l’aide d’un microscope en alimentant les puits qui ne sont pas encore confluents : retirer la moitié du milieu, ajouter du milieu frais et 50 microlitres d’IL ; diviser les puits confluents en resuspendant les cellules, en transférant la moitié des cellules dans un puit vide, puis en ajoutant du milieu frais et 50 microlitres d’IL. Remettre les cellules dans l’incubateur. Les cellules en expansion seront prêtes pour la coloration TEER après 13 à 15 jours de culture.

Étape quatre, visualisation des lymphocytes T par coloration avec du tétraméthylrhodamine, acheter ou assembler des tétramères correspondant au peptide. MHC combinaisons utilisées pour stimuler les lymphocytes T CD4 positifs. Retirer la plaque de l'incubateur.

Retirez soigneusement la moitié du milieu de chacun. Transférez un aliquot de cellules de chaque puits, typiquement 75 microlitres ou environ 50 000 cellules, dans un tube Fax en polystyrène de cinq millilitres, ajoutez la teer, généralement un microlitre par 50 microlitres de volume total, puis placez à l’incubateur à 37 degrés pendant une heure. Il est également conseillé de marquer un second aliquot de chaque puits avec une teer inadaptée comme témoin négatif, puis de marquer les cellules avec des anticorps anti-CD3, anti-CD4 et anti-CD25.

Des marqueurs d'anticorps supplémentaires ou alternatifs peuvent être utilisés. Cependant, n'utilisez pas d'anticorps marqués avec du PE, car ce canal doit rester réservé aux teems pour le moment. Étiquetez également tout contrôle unicolore ou contrôle d'isotype en utilisant des cellules supplémentaires.

Incuber les cellules marquées par anticorps pendant 15 à 30 minutes à quatre degrés. Laver chaque tube avec 0,5 à un millilitre de tampon de lavage et centrifuger à 230 ×g pendant 10 minutes. Éliminer soigneusement le liquide des tubes, étalonner le cytomètre de flux à l’aide de billes de référence, de tubes témoins monocolorés, de témoins d’isotype et ainsi de suite.

Analyser chaque tube à l’aide du cytomètre en flux. Les cellules tétra-positives doivent former une population distincte parmi les lymphocytes T CD4 positifs expansés. Les cellules tétra-positives sont généralement CD25 positives et souvent CD4 haut I.