Traitement du pin taeda PtGen2 cDNA microarray
20 mars 2009
L'ADNc biopuces PtGen2 a été développé pour les études d'expression génique dans le pin taeda, P. taeda, Et d'autres conifères. Ici, nous montrons pré-et post-hybridation manutention et le lavage des techniques qui peuvent être utilisés avec ce tableau de céder une meilleure cohérence, les artefacts réduits, et de milieux.
Ce vidéo a été produite par des chercheurs de l'École de foresterie et de ressources naturelles Warnell de l'Université de Géorgie. L'objectif de cette vidéo de formation est de détailler la manière de traiter notre puces à ADN complémentaire de pin lolly LOB, génération deux, en accordant une attention particulière au lavage et à la manipulation de la puce, avant et après l'hybridation. En général, nos protocoles suivent ceux élaborés à l'Institut de recherche génomique Tiger et à la plateforme partagée de puces à ADN de Vanderbilt, VMSR, où nos puces sont imprimées.
Nous avons constaté qu'un traitement plus rigoureux du PT Gen deux est nécessaire pour assurer le plus haut niveau de cohérence en termes d'uniformité de la qualité du signal et de faibles niveaux de fond. La première étape consiste en un pré-lavage. Nous effectuons cette étape car notre tampon de dépôt contient une concentration très élevée de sel, et ce pré-lavage est indispensable pour éliminer ce sel.
Les lames sont placées dans un porte-lame pour microscope et plongées vigoureusement 15 à 20 fois dans une solution de SDS à 0,2 % préalablement chauffée à 43 degrés. Après le lavage des lames dans la solution de SDS, elles sont retirées délicatement avec des pinces et transférées dans un bocal de Copeland contenant un tampon de pré-hybridation. Ce tampon contient du XSSC 5×, du SDS 0,1 % et de l'albumine sérique bovine (BSA) à 1 %, et est également chauffé à 43 degrés.
Le bocal de Copeland est recouvert de parafilm et placé dans un incubateur à 43 degrés pendant une heure. Après la pré-hybridation, les lames sont transférées dans un porte-lame pour microscope et traitées successivement dans cinq bains d'eau déionisée, en plongeant 15 à 20 fois dans chaque bain. Enfin, les lames sont placées dans de l'isopropanol et trempées cinq ou six fois avant d'être centrifugées à sec dans une centrifugeuse chip M mate.
Après la centrifugation, les lames sont soufflées avec de l'air comprimé passé à travers un filtre de 0,2 micron. Les lames sont ensuite recouvertes de lamelles releveuses, qui ont également été nettoyées avec de l'air comprimé, et nous utilisons une petite pointe de pipette pour ajuster la lamelle releveuse en position correcte sur la lame.
Une fois que les lamelles porte-échantillons ont été positionnées, mais avant d'ajouter le tampon d'hybridation, nous ajoutons 20 microlitres de dihi à 100 millimolaire, trois atol, dans les puits d'humidité situés aux extrémités de la chambre. Nous pouvons maintenant ajouter les ADNc cibles, qui ont été remis en suspension dans le tampon d'hybridation. La pointe de pipette est placée au bord de la lamelle porte-échantillon et de la lame, puis la solution est pipetée lentement.
Nous avons constaté que l'utilisation de l'effet capillaire pour charger les puces assure la plus grande reproductibilité et réduit considérablement l'introduction de bulles indésirables. Une fois que le matériau cible a été ajouté sur la puce, la chambre d'hybridation est assemblée et recouverte de papier d'aluminium. La chambre d'hybridation est ensuite placée dans un bain-marie agité pour une incubation nocturne, généralement de 14 à 16 heures.
Le bain-marie est réglé à 48 degrés et l'agitateu r est réglé à 50 tr/min. Il est également important de noter que, dès l'ajout de la solution d'hybridation et pendant tous les lavages post-hybridation, les procédures sont effectuées à l'abri de la lumière afin d'éviter l'oxydation photochimique. Le jour suivant, les lames sont retirées de la chambre d'hybridation et placées dans un bocal Copeland contenant la solution de lavage numéro un, préalablement chauffée à 53 degrés.
Les lames sont laissées dans le bocal Copeland pendant environ une minute, jusqu'à ce que les supports glissants se détachent ; à ce moment-là, les lames sont délicatement retirées à l'aide de pinces et placées dans un porte-lames destiné au microscope, afin de procéder aux lavages. Ensuite, les lames sont plongées vigoureusement environ 15 à 20 fois dans un second récipient contenant également la solution de lavage numéro un à 53 degrés. Le récipient est alors recouvert de parafilm et placé dans un agitateur aérien incubateur réglé à 53 degrés et 100 tr/min.
Après l'incubation de 10 minutes et la solution de lavage numéro un, les lames sont plongées vigoureusement de 15 à 20 fois dans un récipient contenant la solution de lavage numéro deux, qui est à température ambiante. Ce récipient est recouvert de film parafilm et replacé sur un agitateur à température ambiante pour une incubation de 10 minutes. Enfin, les lames sont retirées de la solution de lavage numéro deux et plongées vigoureusement de 15 à 20 fois dans un récipient contenant la solution de lavage numéro trois.
Les lames sont ensuite transférées dans un deuxième récipient contenant la solution de lavage numéro trois recouverte de perfil, puis à nouveau placées sur l'agitateurs pendant 10 minutes. Après le dernier lavage, nous centrifugeons les lames jusqu'à complète dessiccation. Pour ce faire, nous insérons un bouchon Falcon de 15 ml dans un tube conique de 50 ml, puis nous plaçons les puces côté code-barres vers le bas dans le tube conique.
Les tubes sont ensuite centrifugés dans un rotor à godets oscillants à 1500 tr/min à température ambiante. Après la centrifugation, les lames sont transférées vers un deuxième ensemble de tubes coniques de 50 ml, préalablement recouverts de papier d'aluminium. Les tubes sont ensuite purgés avec de l'azote gazeux, filtré à travers un filtre de 0,22 micron, puis bouchonnés pour le transport ou le stockage jusqu'au balayage.
Nous recueillons les données de numérisation sur un PerkinElmer ScanArray 5 000. L'image du réseau est quadrillée et les données brutes de numérisation sont traitées, puis une analyse initiale des données est effectuée à l'aide de la suite logicielle d'imagerie de Bio Discovery. Ensuite, les intensités des signaux des taches sont normalisées et des analyses statistiques sont réalisées à l'aide de BRB Array Tools, un ensemble statistique robuste et gratuit pour les puces à ADN, disponible en téléchargement sur le site du National Cancer Institute.
D'autres analyses statistiques et recherches de profils d'expression génique sont effectuées à l'aide de la suite d'analyse et de profils d'expression génique Jeep PPAs, un autre logiciel d'analyse gratuit basé sur le web. Merci d'avoir regardé notre vidéo sur la manière de traiter la puces à ADN de pin tapis de sol PT Gen deux.
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Aperçu
Cet article présente la matrice d'ADNc PtGen2, développée pour des études d'expression génique chez le pin à encens et d'autres espèces de conifères. Il décrit les manipulations avant et après hybridation ainsi que les techniques de lavage permettant d'améliorer la reproductibilité et de réduire les artefacts.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Analyse de l'expression génique
- Technologie des puces à ADN
- Biologie végétale
Contexte
- Les puces à ADN complémentaire sont essentielles pour l'étude de l'expression génique.
- PtGen2 est spécifiquement conçu pour le pin maritime et les conifères.
- Les techniques appropriées de manipulation sont cruciales pour des résultats fiables.
- La forte teneur en sel du tampon de dépôt impose un pré-lavage.
Objectif de l'étude
- Améliorer la cohérence des données d'expression génique.
- Réduire le bruit de fond dans les résultats de puces à ADN.
- Fournir un protocole normalisé aux chercheurs.
Méthodes utilisées
- Prélavage pour éliminer le sel du tampon de dépôt.
- Techniques de lavage rigoureux après l'hybridation.
- Comparaison avec les protocoles provenant de laboratoires de recherche reconnus.
- Évaluation de la qualité du signal et des niveaux de fond.
Résultats principaux
- Une amélioration de la cohérence de la qualité du signal a été observée.
- Des niveaux de fond plus faibles ont été obtenus grâce à des techniques affinées.
- Les protocoles ont démontré leur efficacité dans plusieurs expériences.
- Des recommandations pour les études futures ont été fournies.
Conclusions
- Des techniques améliorées de manipulation et de lavage sont essentielles pour la réussite des puces à ADN.
- Des protocoles standardisés peuvent conduire à des données d'expression génique plus fiables.
- Les recherches futures peuvent s'appuyer sur ces résultats pour obtenir de meilleurs rendements.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole répond à un défi majeur en génomique végétale : obtenir des données reproductibles de puces à ADN malgré l'utilisation de tampons de dépôt riches en sels, qui peuvent introduire des artéfacts. En standardisant les étapes de lavage avant et après l'hybridation, la méthode améliore la cohérence des données et réduit le bruit de fond, permettant ainsi un profilage fiable de l'expression génique chez les espèces de conifères. Cette approche contribue aux efforts de validation de cibles en biotechnologie forestière en facilitant la détection plus claire des gènes différentiellement exprimés dans des conditions expérimentales.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation des cibles
- Valeur scientifique : Permet l'analyse des réponses transcriptionnelles dans les tissus de conifères, soutenant la vérification d'hypothèses relatives aux voies de stress ou de développement.
- Valeur opérationnelle : Réduit la variabilité technique due aux artéfacts salins, améliorant la fiabilité de l'identification des cibles.
Élaboration de tests et de criblages
- Valeur scientifique : Produit des lames de puces à ADN standardisées et à faible fond diffus, adaptées à des hybridations reproductibles entre groupes expérimentaux.
- Valeur opérationnelle : Met en place un protocole fiable de préparation des lames, améliorant la reproductibilité et la montée en échelle des tests.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet la détection des mécanismes en fournissant des profils d'expression fiables à partir de tissus de pin, utiles pour l'étude de l'adaptation environnementale ou de la formation du bois.
- Valeur opérationnelle : Facilite la comparabilité entre études grâce à un traitement cohérent des lames, contribuant à la continuité translationnelle.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre dans le flux de travail de biologie de la découverte, en soutenant particulièrement un profilage fiable des cibles dans les systèmes végétaux non modèles où les outils génétiques sont limités.
- Biologie de la découverte : Permet une analyse d'expression guidée par des hypothèses chez le pin à encens, clarifiant les réponses géniques dans les tissus racinaires, les aiguilles et les tiges.
- Tri : Fournit des lames de puces à ADN présentant une qualité de signal uniforme, permettant un tri fiable de l'expression génique dans différentes conditions.
- Analytique : Génère des données d'intensité de signal propres et normalisées, compatibles avec des outils ultérieurs tels que BRB Array Tools et JePPAs pour l'analyse statistique.
- Recherche translationnelle : Soutient la continuité entre la découverte de gènes et la validation fonctionnelle en fournissant des références d'expression fiables.
- Réutilisation en milieu professionnel : Établit un protocole reproductible de préparation de lames pouvant être appliqué à plusieurs espèces de conifères et à divers plans expérimentaux.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Améliore la confiance prédictive des mesures d'expression génique en minimisant les artefacts issus des sels et du SDS.
- Valeur opérationnelle : Renforce la standardisation et la reproductibilité entre les lames et les laboratoires grâce à des étapes définies de lavage et de manipulation.
- Valeur stratégique : Réduit le risque de faux positifs et de faux négatifs dans le profilage d'expression, favorisant de meilleures décisions « aller/ne pas aller » lors de la validation des cibles.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des gènes candidats sur la base de données d'expression plus propres et plus fiables.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des puces à ADN et les techniques d'hybridation.
- Suppose l'accès à des bains-maries thermostatés, des incubateurs et des centrifugeuses pour le traitement des lames.
- Exige des réactifs normalisés, notamment le SDS, le SSC, l'BSA et l'isopropanol, pour les étapes de lavage et de déshydratation.
- Implique une adaptation du contrôle de l'humidité et de la durée d'hybridation selon la source d'ARN cible et la méthode de marquage.
- Limite pratique : la présence d'un tampon de dépôt riche en sels exige un pré-lavage rigoureux ; une élimination incomplète des sels peut subsister si les étapes sont raccourcies.
