Fluorescence microscopie dépistage et séquençage de prochaine génération: des outils utiles pour l'identification des gènes impliqués dans des organites intégrité

L'objectif de cette expérience est d'identifier le gène ou les gènes responsables de l'intégrité morphologique et fonctionnelle des organites végétaux. Cela est réalisé en ajoutant d'abord du méthane sulfonate d'Éthyle comme agent chimique afin d'induire une mutagenèse sur des graines porteuses d'un marqueur fluorescent d'organite. La deuxième étape consiste à récolter les graines provenant de plantes individuelles de la première génération mutagénisée afin de produire des lignées de la génération mutante suivante, M2.

Ensuite, les graines mutagénisées d'Eliana sont observées au microscope confocal ou fluorescent afin d'identifier le phénotype organellaire aberrant. La dernière étape consiste à produire la troisième génération mutagénisée et à confirmer la présence du phénotype mutant. En définitive, la mutation récessive peut être cartographiée à l'aide d'outils de séquençage de nouvelle génération.

Une fois l'emplacement du gène muté identifié, la transformation à l'aide du gène de type sauvage devrait restaurer le phénotype organellaire anormal. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant le maintien de l'intégrité morphologique et fonctionnelle des organites végétaux. Le traitement des graines d'atop sta par le sulfonate de méthane induit des modifications de la cytosine dans le génome, entraînant une transformation de la cytosine en guanine.

Ajout de mutations. Le traitement par EMS est une étape clé de ce protocole pour assurer un taux de mutation optimal au sein des individus M deux. Commencez par obtenir des graines d'Arabidopsis de type sauvage de l'écotype Columbia, qui ont été préalablement modifiées génétiquement pour porter un marqueur fluorescent d'organelle pertinent.

Transférez 0,8 gramme ou environ 40 000 graines dans un tube Falcon de 50 millilitres. Ajoutez ensuite 25 millilitres d'eau distillée et 0,2 % d'Ethel méthane sulfonate. Incubez le mélange pendant 16 heures sur un agitateur mutagène à faible vitesse. Après l'incubation, aspirez le liquide et jetez-le dans un flacon contenant une solution d'hydroxyde de sodium à un molaire.

Pour inactiver l'EMS, ajouter 25 millilitres d'eau dans le tube Falcon contenant les graines. Fermer le tube et le retourner cinq fois pour laver les graines. Une fois que toutes les graines se sont déposées, aspirer l'eau et la jeter dans le flacon de soude à une molaire.

Répétez cette étape de lavage jusqu'à 10 fois après le lavage final, puis placez les graines dans une quantité minimale d'eau. Procédez à la stérilisation des graines en ajoutant 25 millilitres d'eau de javel à 10 % et en agitant vigoureusement pendant 30 secondes. Une fois que les graines se sont déposées au fond, versez l'eau de javel et rincez avec 25 millilitres d'eau stérile.

Après avoir retiré l'eau stérile, ajoutez 25 millilitres d'éthanol à 70 %. Secouez les tubes pendant 30 secondes et laissez les graines se déposer au fond. Versez l'éthanol et rincez avec 25 millilitres d'eau stérile.

Répétez le rinçage avec de l'eau stérile deux fois. Ensuite, versez les graines dans une boîte de Pétri en plastique contenant du papier filtre de trois mm. Laissez les graines sécher sous la hotte après une incubation de deux jours à quatre degrés Celsius.

Placer les graines dans une boîte de Pétri de 150 millimètres à raison d'environ 250 à 300 graines par boîte, dans un milieu demi-Magi et Scoog contenant du gel de fighter. En tant qu'agent gélifiant, faire pousser les graines de la génération M1 sur des boîtes pendant deux semaines. Transplanter les semis en terre et laisser les plantes continuer à croître.

Après 30 à 45 jours, les plantes atteindront le stade mature où les fuites, désormais visibles, seront clairement apparentes. À ce stade, récoltez deux graines M à partir de chaque plante M1 afin de générer 1 000 lignées M2 indépendantes. Afin d'observer les jeunes plants au microscope confocal ou à fluorescence, faites germer 60 graines provenant de chaque lignée M2 pendant sept à dix jours sur des boîtes de Pétri en plastique en demi-force.

Le milieu Moreish et scoog contenant du gel de fighter fait également pousser cinq plantules du témoin non traité par EMS sur la même boîte. Une fois les plantules développées, monter cinq à dix entrées de cos avec le côté scellé ABAC tourné vers l'objectif 40 fois sur une lame de microscope et recouvrir avec un coverslip ; en observation en fluorescence, examiner chaque oléine depuis la région corticale jusqu'à la région médiale afin de détecter une distribution subcellulaire modifiée du marqueur d'organite. Après transplantation des plantes positives en terre et culture des plantules comme décrit précédemment, confirmer que le phénotype mutant est présent à la génération M trois.

Éliminez les mutations parasites en effectuant des croisements récurrents au moins trois fois avec un génome de type sauvage portant le marqueur fluorescent organellaire souhaité, comme décrit dans le protocole écrit. Pour commencer le cartographiage, utilisez le kit plant mini cogen DN Easy Z afin d'extraire environ trois microgrammes d'ADN génomique à partir du M trois, qui représente l'ADN Columbia mutant homozygote. Soumettez cet ADN à un séquençage sur l'analyseur génomique Illumina two 14.

L'étape suivante consiste à croiser le mutant zago de Colombie avec Las Berger afin de produire la descendance chez laquelle la combinaison recherchée peut apparaître après autopolinisation. La génération double mutante résultante servira finalement de population de cartographie contenant le gène d'intérêt responsable de la mutation. En comparant l'ADN génomique de cette population à celui des plantes de type sauvage, il sera possible d'identifier la localisation de la mutation dans le génome.

Après la croissance des plantes F deux, récolter entre 70 et 100 individus F deux présentant le phénotype aberrant et le même nombre de plantes F deux ayant un phénotype sauvage, puis prélever un disque foliaire de chaque plante à l’aide d’un perforateur. Le disque foliaire doit être prélevé sur des feuilles d’âge identique. Afin d’assurer des quantités similaires d’ADN, les échantillons peuvent être traités individuellement ou par groupes pour l’extraction génomique.

Dans ce cas, il est possible de prélever cinq à 10 échantillons pour chaque tube orph eend afin de réduire le nombre de tubes à partir desquels l'ADN génomique doit être extrait. Utilisez le kit de purification d'ADN végétal Master Pure pour extraire l'ADN génomique. L'ADN génomique obtenu à partir de chaque échantillon peut ensuite être quantifié à l'aide d'un NanoDrop.

Ensuite, combiner des quantités égales d'ADN provenant de chaque échantillon jusqu'à un total de 300 nanogrammes, en gardant séparés les échantillons mutés et de type sauvage pour préparer la réaction de marquage : ajouter 60 microlitres de solution de primers aléatoires 2,5 x et 42 microlitres d'eau. Après avoir dénaturé l'ADN à plus de 95 degrés Celsius pendant cinq à dix minutes, placer les échantillons sur de la glace pour dénaturer l'ADN. Ajouter 15 microlitres de 10 X DN tps.

Mélanger avec du DCTP biotiné et compléter par trois microlitres. Glen polymérase. Incuber les échantillons toute la nuit à 25 degrés Celsius.

Le jour suivant, ajouter 15 microlitres d'acétate de sodium à trois molaire et 400 microlitres d'éthanol froid à 100 %. Incuber les échantillons mélangés à moins 80 degrés Celsius pendant une heure après une centrifugation à 20 500 ×g pendant 15 minutes. Laver le culot avec 500 microlitres d'éthanol froid à 75 % après une deuxième centrifugation.

Séchez les culots d'ADN à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Remettez en suspension les culots dans 100 microlitres d'eau et utilisez cinq microlitres pour vérifier le rendement et la qualité sur un gel bio. Des réactions de marquage aléatoire ont été chargées sur un gel d'agarose à 1 % à partir d'un pool de plantes F deux de type sauvage et d'un pool de plantes F deux mutantes.

Comme étape finale, envoyer 95 microlitres de la réaction de marquage de type sauvage et mutante pour l'hybridation sur puces génétiques Arabidopsis ATH1 Genome Array. Après le balayage par l'effaceur, les fichiers de points CL obtenus sont analysés à l'aide de notre logiciel. Après avoir installé notre logiciel, ouvrez le programme et collez la chaîne Bioconductor figurant dans la procédure écrite.

Ensuite, appuyez sur la touche Entrée, ce qui installera les packages BIOCONDUCTOR standard à partir du site web dédié aux puces à ADN, au génotypage et à la cartographie. Téléchargez et décompressez les fichiers listés dans le texte dans un nouveau dossier sur le bureau. Conservez les données obtenues à partir de l'expérience avec la puce à gènes pour le type sauvage C, L, et le mutant C. Copiez maintenant les données de la puce à gènes pour le type sauvage C et le mutant C dans le dossier.

Ensuite, ouvrez R sur un PC. Cliquez sur Fichier, puis sur Changer le répertoire. Sélectionnez le dossier contenant les fichiers, cliquez sur Fichier, sur Charger l'espace de travail, puis sélectionnez A one V five R data open read C do R à l'aide du Bloc-notes et copiez tout le texte dans R. Sur un Mac, cliquez sur Mis, puis sur Changer le répertoire de travail.

Sélectionnez le dossier contenant les fichiers. Cliquez sur charger l'espace de travail, puis sélectionnez le fichier de données ATH un V cinq R. De la même manière, ouvrez SFP R et MAP R à l'aide d'un éditeur de texte, copiez le texte et collez-le dans la console R.

Un message apparaîtra pour rechercher des gènes dans la ressource d'information sur Arabidopsis ou TAIR. Copiez et collez le lien trouvé dans le texte dans le navigateur Internet. Une fenêtre s'affichera et demandera d'ouvrir ou d'enregistrer le fichier.

Sélectionnez enregistrer. Choisissez un nom de fichier et ajoutez l'extension. Faites x ls.

Ensuite, cliquez sur enregistrer. Voici un résultat typique attendu. Après analyse des données obtenues à partir de la puce à gènes Arabidopsis H un réseau génomique, cette figure représente un exemple de cartographie de la mutation Columbia zéro utilisant la puce à gènes Arabidopsis, une hybridation génomique H un, où les barres horizontales représentent les seuils de détection.

La mutation dans cet exemple est située sur le chromosome un, délimité par des barres verticales. Ouvrez le fichier dot XLS pour trouver les coordonnées du mutant dans la région cartographiée. Dans les lectures Illumina assemblées du génome mutant, identifiez les transitions EMS spécifiques parmi les polymorphismes nucléotidiques simples.

Une fois maîtrisée, l'approche décrite dans ce protocole peut être utilisée pour cartographier un gène dans un délai relativement court par rapport à la méthode de cartographie classique.