Mesure Life Span réplicative dans la levure bourgeonnante

La levure bourgeonnante Croce Visi a été largement utilisée pour étudier la biologie du vieillissement. Dans cet article, nous présentons un protocole général pour mesurer la durée de vie réplicative des cellules mères de levure. Bonjour, je suis Kristen Steffen du laboratoire de Brian Kennedy du Département de biochimie de l'Université de Washington.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant de mesurer la durée de vie réplicative des cellules mères de levure. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les gènes qui influencent la durée de vie des cellules de levure. Commençons donc.

Pour l'expérience d'analyse de la durée de vie réplicative et la préparation des cellules de levure en vue de l'analyse de leur durée de vie, il est nécessaire de préparer des plaques YEPD solides. Utilisez une technique stérile appropriée pour préparer ces plaques d'agar YEPD. Préparez au moins deux plaques pour chaque groupe de quatre à cinq souches à analyser dans l'expérience de durée de vie.

Ces boîtes doivent être préparées au moins deux jours avant l'expérience d'espérance de vie et laissées sécher avant de commencer le test de durée de vie. Si l'expérience n'a pas lieu dans un délai de quatre à cinq jours après la coulée des boîtes, celles-ci doivent être enveloppées dans du film parafilm ou du plastique et placées dans un incubateur réfrigéré afin d'éviter la dessiccation. Retirer les souches de levure des stocks congelés et les strier pour obtenir des colonies isolées.

Sur les boîtes de gélose YEPD. Jusqu'à six souches peuvent être aisément étalées sur la même boîte de YEPD en divisant la boîte en secteurs égaux en forme de parts de tarte. Incuber les cellules à 30 degrés Celsius pendant deux jours.

Après l'incubation, retirez les cellules de l'incubateur et prélève une cellule d'une colonie unique pour la transférer sur une nouvelle boîte YEPD. À ce stade, les souches à analyser doivent être enrobées afin de garantir que l'expérience de durée de vie réplicative soit réalisée en aveugle, c'est-à-dire que les personnes effectuant les dissections ne connaissent pas l'identité des souches individuelles.

Ensuite, incuber les cellules ensemencées et recouvertes à 30 degrés Celsius jusqu'au lendemain soir. Retirer les cellules et ensemencer légèrement les cellules de chaque souche recouverte sur des plaques YEPD fraîches. Ces plaques serviront de plaques expérimentales pour la détermination de la durée de vie réplicative.

Les cellules d'analyse doivent être déposées en une ligne verticale sur le côté gauche de la boîte de YEPD. Ne pas transférer trop de cellules sur une seule boîte de YEPD fraîche. En effet, cela provoquerait une croissance dense des cellules durant l'incubation nocturne et affecterait leur durée de vie réplicative ; environ trois à cinq prélèvements par boîte sont optimaux.

En supposant que l'analyse de la durée de vie réplicative sera effectuée sur 20 cellules provenant de chaque patch, l'expérience de durée de vie est désormais entièrement préparée et il suffit de l'incuber toute la nuit à température ambiante. Ensuite, demain, nous pourrons commencer la microdissection afin de positionner les cellules de levure sur la plaque et obtenir des cellules filles vierges pour l'analyse de la durée de vie réplicative.

Utilisez un microscope équipé d'un appareil de microdissection adapté aux levures. Transférez environ 50 cellules à partir de la première souche en patch vers une position sur la plaque éloignée des cellules en patch. Si le plateau de votre microscope est gradué, ces graduations peuvent être utilisées pour s'assurer que les cellules seront faciles à retrouver lors des itérations ultérieures.

Parfois, des cellules peuvent rester coincées dans l'aiguille, ce qui peut poser problème si elles sortent au mauvais moment. Pour s'assurer que l'aiguille est propre et débarrassée de toute cellule, touchez-la à plusieurs reprises à la surface de l'agar. Ensuite, créez un trou dans l'agar en enfonçant l'aiguille à travers sa surface.

Cet orifice servira de marqueur pour vous orienter sur la plaque lors des itérations ultérieures de dissection et de retrait des cellules dotter. Veillez à ne pas introduire de cellules de levure dans l'orifice, car elles pourraient croître et former une colonie juste au-dessus de celui-ci. Alignez verticalement des cellules de levure individuelles en 20 positions régulièrement espacées, avec un à trois diamètres d’aiguille entre chaque position cellulaire.

Pour chaque groupe de quelques cellules, placer deux cellules côte à côte à la même position dans la ligne, plutôt qu'une seule. Cela permet une redondance lors de la sélection des cellules filles vierges. Si l'une des cellules transférées ne se divise pas entre les positions 10e et 11e de la ligne, créer une série horizontale de sept à huit trous dans l'agar.

Cela servira de marqueur pour vous orienter sur la plaque lors des dissections ultérieures et du retrait des cellules filles. Veillez encore une fois à ne pas introduire de cellules de levure dans les trous, car elles pourraient croître et former une colonie. Répétez cette procédure pour chaque tache sur la plaque, en continuant d'aligner les cellules verticalement le long du même axe.

Il est important de se rappeler que lors de la création du trou dans l'AER, le nombre de trous réalisés doit correspondre au numéro du patch, de sorte qu'il y ait un trou pour le premier patch et deux trous pour le second. Une fois les cellules disposées pour chaque patch, parafilm le plat et incube à 30 degrés Celsius pendant environ deux heures. N'oubliez pas que, dorénavant, tous les plats doivent être parafilmés, sauf lorsqu'ils sont en cours de dissection.

Afin d'éviter le dessèchement, répétez cette procédure pour chaque plaque. Dans l'expérience. Pour l'analyse de la durée de vie, il est important de s'assurer que chaque cellule démarre comme une cellule fille vierge.

Pour ce faire, retirez d'abord les plaques de l'incubateur et vérifiez que la majorité des cellules de la matrice ont subi une division cellulaire. Ce que nous avons ici, ce sont des cellules qui ont été alignées précédemment, et vous pouvez constater qu'après deux heures dans l'incubateur, elles ont commencé à se diviser. Nous avons maintenant une cellule mère, la plus grande, attachée à sa cellule fille vierge, et cette cellule fille vierge est celle qui sera utilisée pour commencer la durée de vie.

Si un temps supplémentaire est nécessaire pour permettre aux divisions cellulaires de s'achever, remettez la plaque dans l'incubateur. Commencez par la première cellule de la matrice. Utilisez l'aiguille pour détacher les cellules filles de la cellule mère en plaçant délicatement l'aiguille sur les cellules attachées.

Il peut parfois être utile de tapoter le côté de la base du microscope pendant que l'aiguille est en appui sur les cellules. Ensuite, placer la cellule fille détachée dans l'alignement vertical des cellules, en remplaçant la cellule mère et toute autre cellule fille, et déplacer temporairement celles-ci sur le côté. Répéter ces étapes pour chacune des cellules de la série.

Si une cellule ne parvient pas à se diviser, prélevez une cellule fille parmi les cellules redondantes situées à côté de la cellule test. Une fois terminé, vous devez disposer de 20 cellules filles pour chaque carie, alignées verticalement sur la plaque de durée de vie. Rassemblez toutes les cellules mères et les cellules filles supplémentaires en un tas, puis transférez-les vers une zone proche des caries appelée le cimetière.

Il est important de maintenir les cellules indésirables à distance des cellules faisant l'objet d'une analyse de durée de vie afin d'éviter la formation de micro-colonies et l'épuisement des nutriments locaux. Une fois les cellules séparées, retirez-les de la plaque et incubez-les à 30 degrés Celsius pendant environ deux heures. Répétez ces étapes pour chaque plaque de l'expérience.

Pour mesurer la capacité réplicative de cellules individuelles, vous devrez préparer des fiches de durée de vie. Une fiche de durée de vie peut être une grille simple où chaque ligne correspond à une cellule mère individuelle et chaque colonne correspond à un point d'âge. Veillez à étiqueter chaque fiche de données en fonction du nombre de souches à analyser.

Pour commencer, retirez d'abord les plaques de l'incubateur et vérifiez que la majorité des cellules de la matrice ont subi au moins une division cellulaire. Si un temps supplémentaire est nécessaire pour permettre l'achèvement de la division cellulaire, remettez la plaque dans l'incubateur. Commencez par la première cellule de la matrice sur la première plaque, puis observez visuellement la cellule mère et la cellule ou les cellules filles afin de déterminer le nombre de divisions cellulaires survenues.

Il est généralement facile de déterminer combien de cellules filles une cellule mère a produites en se basant sur des motifs caractéristiques d'arrangements cellulaires. Celui-ci est particulièrement simple à observer, car il y a deux cellules de taille identique et toutes deux plus petites que la cellule mère. Notez le nombre de cellules filles produites par la cellule mère dans la case appropriée de la feuille de notation de durée de vie.

Ensuite, utilisez l'aiguille pour détacher les cellules filles de la cellule mère comme décrit précédemment, en plaçant délicatement l'aiguille sur les cellules attachées et en tapotant le côté de la base du microscope pendant que l'aiguille repose sur les cellules. Maintenez la cellule mère en place sur la ligne verticale et déplacez temporairement la ou les cellules filles sur le côté. Répétez ces étapes pour chacune des cellules du réseau.

Enfin, récupérez toutes les cellules filles éliminées et transférez-les dans le cimetière situé près des patchs d'origine. Scellez la plaque avec du film parafilm et incubez à 30 degrés Celsius pendant deux à trois heures. Répétez l'élimination des cellules filles et l'incubation.

Étape pour chaque plaque de l'expérience. Répétez cette procédure complète jusqu'à ce que toutes les cellules mères aient cessé de se diviser. Gardez à l'esprit que, lorsque les cellules mères vieillissent, la progression du cycle cellulaire ralentit et il sera souhaitable d'incuber la plaque pendant des périodes plus longues entre les points d'âge ; par la suite, les plaques peuvent être placées à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Les données brutes produites par une expérience de durée de vie réplicative correspondent à une liste de nombres représentant les cellules filles produites par chaque cellule mère à chaque point d'âge. Comme indiqué ici. En additionnant chaque ligne de la feuille de notation, on obtient la durée de vie réplicative de chaque cellule mère.

Les données provenant d'autres cellules du même groupe expérimental peuvent être regroupées afin de générer une courbe de survie et d'effectuer des calculs statistiques. La courbe devrait être approximativement conforme à la cinétique de Gompertz-Makeham, présentant une forme sigmoïde avec une faible mortalité précoce, suivie d'un déclin relativement rapide de la survie et d'un aplatissement de la courbe à des âges plus avancés. Nous venons de vous montrer comment réaliser une expérience de durée de vie réplicative chez la levure.

Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de garder à l'esprit que les cellules continueront à se diviser chaque fois qu'elles ne sont pas au froid. Veillez donc à placer les boîtes à quatre degrés pendant la nuit afin de ne pas vous retrouver avec trop de cellules filles à compter le matin. Voilà, c'est tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.