Etudier Instabilité génomique fonction de l'âge en utilisant les S. cerevisiae Modèle chronologique Lifespan

L'objectif général de cette procédure est d'étudier l'instabilité génomique dépendante de l'âge chez la levure en combinant la durée de vie chronologique à un ensemble d'essais simples de dommages et de mutations de l'ADN. Cela est réalisé en prélevant d'abord des échantillons de cultures vieillissantes tous les deux jours et en vérifiant la viabilité par la formation d'unités formant colonies, ou UFC. L'étape suivante de la procédure consiste à examiner les mutations de l'ADN en prélevant des échantillons de cultures vieillissantes et en ensemencant les cellules sur un milieu de sélection spécifique aux mutations.

En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent les modifications des mutations de l'ADN au cours du vieillissement chronologique de la levure, en normalisant les résultats du test de mutation par rapport à la viabilité. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du vieillissement, telles que les mécanismes reliant le vieillissement et l'instabilité génomique. Pour mesurer la durée de vie chronologique de la levure, ou CLS, inoculer d'abord une colonie unique de levure dans un millilitre de milieu synthétique complet au glucose, ou milieu SDC, et incuber toute la nuit avec agitation à 30 degrés Celsius. Le jour suivant, diluer la culture de nuit dans 10 millilitres de milieu SDC frais jusqu'à une DO 600 comprise entre 0,05 et 0,1, puis incuber avec agitation à 30 degrés Celsius pendant trois jours.

Le troisième jour, lorsque les cellules sont en phase stationnaire, diluez chaque culture Eloqua 10 000 fois dans de l'eau stérilisée, puis prélevez deux aliquotes de 10 microlitres à partir du flacon et ensemencez 10 microlitres de chaque culture diluée sur une boîte de milieu A-Y-E-P-D. Incubez la boîte à 30 degrés Celsius jusqu'à l'apparition de colonies. Le nombre de colonies obtenues, ou unités formant colonies, issu de la culture du troisième jour est considéré comme un taux de survie de 100 %.

Continuer à prélever des aliquotes de la culture vieillissante pendant les jours suivants pour les ensemencer. Ajuster en conséquence les facteurs de dilution afin d'obtenir environ 20 à 100 colonies dans le test d'UFC. L'échantillonnage est arrêté lorsque la viabilité de la culture a diminué en dessous de 1 %, généralement entre les jours 11 et 13 ; la viabilité cellulaire peut également être étudiée chez des cellules vieillies sur boîtes de Petri.

Pour commencer ce test, inoculer une colonie unique dans un millilitre de milieu synthétique complet au glucose, puis incuber toute la nuit sous agitation à 30 degrés Celsius. Lorsque la culture a atteint environ 10 puissance 8 cellules par millilitre, diluer la culture avec de l'eau stérilisée au autoclave à 100 à 200 cellules par 10 microlitres et à 1000 cellules par 10 microlitres. Pour chaque souche, préparer un ensemble de huit à vingt plaques SDC sans tryptophane étiquetées selon la densité de mise en culture.

Pour s'assurer que 10 à 100 colonies puissent être comptées, en prévision d'une viabilité réduite au cours du vieillissement, déposez deux aliquots de 10 à 30 microlitres de culture diluée sur chaque boîte. Incubez l'ensemble des boîtes à 30 degrés Celsius pendant toute la durée de l'analyse de la durée de vie ; le jour de la mise en boîte et tous les deux jours par la suite, retirez une boîte et ajoutez goutte à goutte 0,5 millilitre de tryptophane afin de permettre la croissance des cellules viables. Incubez la boîte à 30 degrés Celsius pendant 48 à 72 heures supplémentaires.

Après 48 à 72 heures, dénombrer les UFC pour évaluer la viabilité au jour de l'ajout de tryptophane afin de mesurer les dommages de l'ADN et la fréquence des mutations durant le vieillissement chronologique. Un certain nombre de souches présentant des caractéristiques particulières sont cultivées en parallèle avec la souche de type sauvage pour le test de durée de vie de la levure.

La fréquence des mutations spontanées peut être évaluée en mesurant la fréquence de résistance à la canavanine dans une culture vieillissante sur le plan chronologique. Des mutations dans le gène *can1*, qui code pour la perméase plasmique de l'arginine, confèrent aux cellules une résistance à l'analogue de l'arginine, la L-canavanine. Les cellules résistantes à la canavanine poussent sur des boîtes de milieu synthétique complet sans arginine, supplémenté en sulfate de L-canavanine. La mesure de la fréquence de réversion en positif pour la tryptophane dans une souche portant une mutation amber dans le gène *trp1* permet d'estimer le taux de substitution de bases durant le vieillissement chronologique de la levure.

Les cellules ayant subi une réversion positive pousseront sur des plaques dépourvues de tryptophane. La souche lyse négative EH150 porte une mutation par décalage du cadre de lecture de +4 dans le cadre ouvert de lecture, entraînant une auxotrophie pour la lysine, qui peut être corrigée par de petites insertions ou délétions. Les revertants seront sélectionnés sur des plaques dépourvues de lysine afin de détecter des réarrangements chromosomiques majeurs ou GCR.

Une souche mutante est utilisée, dans laquelle HX T 13, situé à 7,5 kilobases en position télocentrique par rapport à can un sur le chromosome cinq, est interrompu par une cassette U trois. Des mutations dans les deux gènes can un et U trois rendent les cellules résistantes respectivement à l’El Canavan et à l’acide cinq fluoro-orotique. Étant donné que la fréquence des mutations ponctuelles survenant dans les deux gènes est faible, l’analyse de la fréquence de résistance à l’El Canavan et à l’acide cinq fluoro-orotique fournit une estimation des recombinaisons à grand rayon (gcr) afin de surveiller le niveau de recombinaison homologue et non homologue. Au cours du vieillissement chronologique, des mutants sont générés qui portent soit des répétitions inversées homologues à 100 %, soit des répétitions homologues à 91 %.

La recombinaison entre les sites IRS au locus his trois permet l'expression d'une protéine his trois fonctionnelle. Par conséquent, les cellules dans lesquelles une recombinaison s'est produite pousseront sur des plaques sans histidine supplémentées en galactose. Au troisième jour, lorsque les cellules sont en phase stationnaire, une quantité appropriée de cellules sera prélevée de chaque culture vieillissante.

Étant donné que la même procédure est utilisée pour tous les dosages, un seul échantillon sera traité. Aux fins de cette vidéo, faire tomber les cellules en les centrifugeant dans une centrifugeuse de banc. Éliminer le surnageant et resuspendre les cellules dans un millilitre d'eau stérilisée par autoclavage.

À nouveau, retirez le surnageant et resuspendez le culot cellulaire dans 100 microlitres d'eau. Plaquez les cellules sur les boîtes appropriées pour sélectionner les révertants désirés. Incubez les boîtes à 30 degrés Celsius et, après trois à quatre jours, dénombrez les UCF. La fréquence de mutation est normalisée par rapport au nombre de cellules viables. Ce graphique montre des résultats représentatifs obtenus lors d'un dosage typique de durée de vie chronologique, lorsque la survie chronologique de cellules de type sauvage est comparée à celle des mutants S CH neuf delta TOR un delta et RAs deux delta.

Dans des cultures liquides, les mutants dépourvus de TOR un, CH neuf ou RAs deux présentent une durée de vie chronologique prolongée. De plus, les déficiences en s CH neuf et RAs deux montrent un effet additif sur la promotion de la longévité et la survie chronologique en présence de diverses sources de carbone. L'essai de viabilité NC deux est illustré dans le graphique suivant.

Jour un, les cultures sauvages de SDC ont été diluées et ensemencées sur des boîtes de milieu SC triplement privé sans source de carbone. Les boîtes de milieu SC triplement privé supplémentées avec du glucose, de l'éthanol ou du glycérol ont été incubées à 30 degrés Celsius ; toutes les deux journées, une boîte a été prélevée de chaque série et les nutriments appropriés ont été ajoutés afin de permettre la croissance et la formation de colonies.

La fréquence des mutations dépendante de l'âge varie considérablement selon la souche, le fond génétique, la manipulation génétique, la culture, les conditions et l'âge. Ce tableau présente les résultats typiques obtenus avec une souche sauvage. Les résultats représentatifs de la synthèse translésionnelle sont montrés sur cette image suivante.

L'augmentation de la fréquence des mutations dépendante de l'âge pourrait impliquer des modifications de la réparation erronée de l'ADN à l'aide d'extraits nucléaires et de divers modèles d'ADN. Nous pouvons évaluer la synthèse par translesion ou TLS dans les cellules vieillies de manière chronologique. Des extraits nucléaires provenant de cellules en phase stationnaire âgées de trois jours, de type sauvage et de mutants SCH nine delta ont été analysés.

Les produits TLS avec un brin matrice intact sont indiqués par des lignes continues, tandis que les produits TLS avec un brin matrice endommagé sont indiqués par des lignes pointillées. Aucune synthèse translésionnelle n'a été observée dans les extraits nucléaires provenant du mutant longévité s CH neuf delta ; les amorces libres sont indiquées par la flèche ouverte. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer l'analyse de la durée de vie chronologique et de l'analyse des mutations de l'ADN chez la levure.