Identification des complexes protéiques avec la protéomique quantitative chez S. cerevisiae

Cette procédure commence par la culture de la souche appât dans un milieu contenant des acides aminés normaux pour la souche témoin SLAC, ainsi que de la lysine et de l'arginine isotopiquement lourdes. Des quantités égales des deux souches sont mélangées et lysées par broyage en présence d'azote liquide. Les lysats bruts sont d'abord mis en pellet par centrifugation, puis clarifiés par liaison à des billes sphéros. Le lysat cellulaire est ensuite lié à des billes IgG.

Les protéines liées aux billes IgG sont élutées par protéase, clivées et précipitées. L'échantillon est désormais prêt à être analysé par spectrométrie de masse. Bonjour, je suis Jesse Chao du laboratoire Lone du Département de biologie cellulaire et environnementale à l'Institut des sciences de la vie de l'Université de la Colombie-Britannique.

Aujourd'hui, nous vous présentons une procédure d'analyse protéomique quantitative appelée SILAC, combinée à la purification par affinité. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les complexes protéiques.

Commençons. Dans cette procédure, la souche appât contient des acides aminés normaux, tandis que la souche témoin SLAC contient des isotopes lourds de lysine et d'arginine. Pour commencer, faites d'abord croître séparément un litre de la souche appât et un litre de la souche témoin jusqu'à la valeur indiquée sur votre écran. Ensuite, versez la culture dans des tubes à centrifuger Nalgene de 500 millilitres.

Équilibrez la charge dans les cellules en pellet à 2 580 RCF, décantez le milieu et resuspendez le culot. Avec 50 millilitres d’eau distillée froide, tout en transférant les cellules vers des tubes de centrifugation de 50 millilitres, centrifugez les tubes pour former un culot cellulaire à 3 000 RCF. À ce stade, vous pouvez congeler le culot à −80 °C.

Il est important de se rappeler d'apparier la culture de la souche témoin à la culture de la souche appât en rapport un pour un selon le poids du culot sec. Resuspendre chaque culot cellulaire dans 10 millilitres de tampon NP-40 contenant un inhibiteur de protéase à une dilution de un sur 2000. Mélanger les deux cultures cellulaires en versant directement le contenu d'un tube dans l'autre.

Pour commencer le broyage des cellules, versez de l'azote liquide dans le mortier prérefroidi et laissez-le s'évaporer complètement. Ensuite, ajoutez deux millilitres de cellules dans le mortier. Versez un peu d'azote liquide pour congeler les cellules.

Broyez les cellules jusqu'à ce qu'elles deviennent une poudre fine. Répétez le processus jusqu'à ce que toutes les cellules soient broyées. Veillez à ne pas laisser les cellules dégeler.

Ajouter de l'azote liquide si nécessaire. Ensuite, transférer la poudre dans un bécher glacé et laisser décongeler à température ambiante. Lorsque les bords commencent à décongeler, ajouter 20 millilitres de tampon NP-40 contenant un inhibiteur de protéase PIC à une dilution de 1/200 après décongélation.

Transférez le lysat brut dans des tubes Nalgene de 40 millilitres et centrifugez à 16 000 tr/min dans un rotor Sovos SA 600 pendant 30 minutes. Pendant ce temps, prélevez 300 microlitres des billes SROs two B et lavez les billes trois fois avec 300 microlitres de tampon NP-40. Ensuite, resuspendez les billes dans 300 microlitres de tampon afin d'obtenir une suspension à ratio un pour un.

L'étape suivante consiste à pré-éliminer les impuretés du lysat cellulaire. Pour ce faire, transférez d'abord le surnageant dans un nouveau tube et ajoutez les billes Spheros two B. Incubez sur une plateforme rotative dans une chambre froide pendant 30 minutes.

Pendant l'incubation, prélevez 300 microlitres de SRO d'IgG six billes et lavez les billes trois fois dans 300 microlitres de tampon NP-40. Resuspendez ensuite les billes dans 300 microlitres de tampon afin d'obtenir une suspension au ratio un pour un. Après l'incubation, centrifugez les SRO pour former un culot.

Deux billes doivent être présentes. Transférez le surnageant dans un nouveau tube. N'oubliez pas de conserver un aliquot du lysat cellulaire pour une analyse par immunotransfert ultérieurement.

Ensuite, ajoutez les billes IgG. Répartissez le contenu dans deux tubes pour une liaison plus efficace, puis incubez pendant deux heures sur une plateforme rotative dans une chambre froide. Après l'incubation, récupérez les billes dans une colonne de chromatographie à quatre degrés Celsius.

Veillez à conserver un aliquot de la fraction non liée. Lavez les billes avec 10 millilitres de tampon NP-40.

Ensuite, lavez les billes avec trois millilitres de tampon TEVC. Là encore, pensez à conserver un aliquot des billes.

Cela reflétera l'efficacité de la liaison permettant d'éluer les billes. Ajoutez d'abord cinq microlitres d'A-C-T-E-V à un millilitre de tampon TEVC. Ajoutez le tampon TEVC aux billes et mélangez.

Transférez le contenu dans deux tubes EINOR de 1,5 millilitre pour un mélange plus efficace et incubez toute la nuit sur une plateforme rotative dans une chambre froide. Ensuite, centrifugez pour faire tomber les billes et transférez l’éluat dans un tube frais de 1,5 millilitre. Lavez les billes avec 0,5 millilitre supplémentaire de tampon TEVC après le lavage.

Combinez les huit dans un seul tube. Vous devriez obtenir au total 1,5 millilitre d'ELU huit. Conservez un aliquot d'ELU TEV huit pour précipitation.

Ajuster les aliquotes à 25 % d'acide trichloroacétique (TCA) à l'aide d'acide TCA à 100 %. Pour ce faire, répartir les 1,5 millilitre de LU huit en deux tubes de 750 microlitres chacun. Ajouter 250 microlitres de TCA à 100 % dans le tube.

Votre solution devrait devenir trouble. Ensuite, placez-la sur de la glace pendant 30 minutes. Vortexez périodiquement le mélange après l'incubation.

Faire centrifuger à vitesse maximale dans une centrifugeuse de table, en chambre froide, pendant 30 minutes. Laver une fois avec 500 microlitres d'acétone glacée contenant de l'acide chlorhydrique à 0,05 normal. Puis centrifuger pendant cinq minutes à vitesse maximale à quatre degrés Celsius.

Ensuite, lavez une fois avec 500 microlitres d'acétone glacée et centrifugez pendant cinq minutes à vitesse maximale à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, retirez soigneusement l'acétone et séchez le culot pour la coloration argent. Resuspendez le culot dans 50 microlitres de tampon d'échantillonnage SDS à une fois la concentration.

Si vous prévoyez d'utiliser la protéine précipitée pour une analyse basée sur la spectrométrie de masse, il est recommandé de procéder à la précipitation à l'éthanol. Pour ce faire, ajoutez d'abord 20 microgrammes de glycogène, puis diluez les échantillons cinq fois avec de l'éthanol à cent pour cent et ajustez à 50 millimolaire de bicarbonate de sodium à l'aide d'une solution mère à 2,5 molaire, à pH 5,0. Mélangez la solution en retournant le tube.

Laisser reposer deux heures à température ambiante. Finalement, répartir le contenu dans deux tubes Eppendorf. Récupérer la protéine précipitée en culot par centrifugation pendant 10 minutes à 12 000 ×g à température ambiante.

L'aliquot conservé pendant la procédure de purification devrait inclure le lysat cellulaire pré-clarifié, la fraction liée, la fraction non liée et la fraction élutée. Nous recommandons d'analyser la teneur en protéines des aliquots mentionnés ci-dessus par immunotransfert (Western blot) à l'aide d'un anticorps anti-TAP ou par coloration argent afin d'évaluer l'efficacité de liaison et d'élution de l'expérience. Sur ce gel coloré par l'argent, SCS purifié portant deux étiquettes TAP ainsi que ses partenaires d'interaction ont été visualisés et comparés à un témoin non marqué dans ce Western blot.

Diverses fractions prélevées lors de la purification de SCS two tap ont été analysées par immunotransfert en utilisant un anticorps anti-TAP. On observe que SCS two tap migre à un poids moléculaire inférieur après élution par clivage à la protéase TEV, et qu'aucun SCS two tap n'est resté sur les billes IgG après élution. Ceci confirme que la purification était hautement efficace.

Nous venons de vous montrer comment purifier des complexes protéiques par purification d'affinité à l'aide de billes IgG. Lors de cette procédure, il est important de veiller à appairer la souche de base et la souche témoin selon leur poids sec de culot avant de commencer la purification. Étant donné que LAC nous fournit des mesures non biaisées et appariées des partenaires de liaison protéique, nous réalisons uniquement la première étape de la purification TAP afin de minimiser la perte d'échantillon.

Si vous observez des quantités importantes de liaison non spécifique, vous pouvez effectuer l'intégralité du protocole, disponible dans le manuel de Cold Springing Harbor. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

Hé, allez, Mark. Ah, vas-y.