Identification des complexes protéiques dans

L'objectif de cette expérience est d'identifier les protéines, les interactions protéiques et la composition en sous-unités des complexes MultiPro natifs provenant d’e. coli. Ceci est réalisé en amplifiant des produits PCR linéaires spécifiques à la séquence, codant pour la marque SPA et un marqueur sélectionnable, qui sont intégrés et exprimés en phase comme fusions carboxy-terminales dans un fond ddy 3, 3 0 à l’aide du système de recombinaison bactérienne Fage lambda. Dans une deuxième étape, une purification double est effectuée à l’aide de billes d’affinité cow modlin et Anti-Flag afin de récupérer efficacement les complexes protéiques peu abondants. Ensuite, les protéines liées, élutées avec cow modlin, un tampon d’élution ou CEB, sont digérées par la trypsine et analysées par spectrométrie de masse pour l’identification des protéines.

Les résultats obtenus montrent que plusieurs sous-unités de l'enzyme ARN polymérase, y compris les facteurs de terminaison de la transcription et les facteurs anti-détermination, co-purifient efficacement avec la sous-unité D de l'ARN polymérase marquée, indiquant que les composants nouvellement associés peuvent être efficacement identifiés à l'aide de cette approche. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés lors des deux cycles de purification par affinité, où un traitement soigneux des lysats cellulaires à l'aide de solutions tampons appropriées est absolument nécessaire pour assurer la récupération efficace des complexes porteurs de faible et de forte abondance à partir de cultures à grande échelle. La réalisation des procédures de purification par affinité et de spectrométrie de masse sera démontrée par Olga Kagan et HBO guo, deux techniciennes de mon laboratoire. Ce protocole commence par le ciblage de séquences amplifiées spécifiques vers la souche DDY trois 30, dans laquelle le système de recombinaison Lambda red est exprimé comme décrit dans le protocole écrit.

Ensuite, cultiver la souche exprimant le système de recombinaison bactériophage Lambda pendant la nuit dans deux millilitres de milieu Luria bacto ou milieu LB à 32 degrés Celsius, sous agitation à 180 tr/min. Le jour suivant, ensemencer un millilitre de la culture de nuit dans 70 millilitres de milieu LB frais, dans un flacon conique de 500 millilitres. Faire croître l'inoculum à 32 degrés Celsius sous agitation à 180 tr/min jusqu'à ce que la DO à 600 atteigne environ 0,8. Induire les cellules en incubant le flacon dans un bain-marie à 42 degrés Celsius, sous agitation douce à 180 tr/min, pendant 15 minutes.

Immédiatement après l'induction, incuber le flacon dans un bain de glace pilée et d'eau pendant au moins 30 minutes sous agitation. Après avoir récolté et lavé les cellules comme décrit dans la procédure écrite, Reese resuspend le culot cellulaire dans 700 microlitres d'eau stérile, froide et glacée, produisant ainsi des cellules électrocompétentes par électroporation. Introduire un microlitre de l'amplicon purifié dans 40 microlitres des cellules électrocompétentes.

Les cellules sont électroporées après la recombinaison homologue et l'intégration. Les transformants ayant correctement recombiné le marqueur ou cassette dans le chromosome sont sélectionnés en fonction de leur résistance à la canamycine ; sélectionnez plusieurs transformants pour un immunoblot afin de vérifier la production correcte des protéines de fusion marquées SPA à l’aide de l’anticorps Anti-Flag M2, spécifique des épitopes Flag du marqueur SPA. Transférez 10 millilitres de la culture de nuit dans 990 millilitres de milieu TB frais, supplémenté avec 25 microgrammes par millilitre de canamycine, dans un flacon de quatre litres.

Faire croître la culture à 32 degrés Celsius avec agitation constante à 250 tr/min pendant cinq à six heures, jusqu'à ce que la DO 600 atteigne une valeur comprise entre 2 et 3. Transférer un litre de la culture d'E. coli avec marqueur SPA dans des bouteilles de centrifugation propres et centrifuger les cellules à 4 degrés Celsius et à 3 993 ×g pendant 15 minutes. Après avoir resuspendu les cellules comme décrit dans le protocole écrit.

Transférez les échantillons dans un récipient stérile en acier inoxydable placé sur de la glace pour la sonication. Immergez la sonde dans l'échantillon et soumettez-le à la sonication pendant trois minutes. Après la sonication, laissez refroidir l'échantillon deux minutes supplémentaires afin d'éviter toute surchauffe, puis procédez à la centrifugation du lysat soniqué.

Transférez soigneusement le surnageant S du tube de centrifugation vers un tube Falcon en polypropylène de 50 millilitres. Congelez l'échantillon à l'aide d'azote liquide et conservez l'extrait cellulaire soniqué congelé pendant une période maximale de six mois à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Pour commencer la purification par affinité de l'extrait cellulaire soniqué congelé, placez le tube dans de l'eau froide, puis incubez l'extrait cellulaire TH avec trois microlitres de benzo, une nucléase, pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

À ce mélange, ajoutez le détergent non ionique Triton X-100 et 200 microlitres de suspensions de billes Anti-Flag M2 agro. Mélangez délicatement le contenu en faisant tourner le tube pendant trois heures à quatre degrés Celsius. Après trois heures de rotation, centrifugez le tube à 1 700 ×g pendant six minutes. Après la centrifugation, retirez soigneusement autant de surnageant que possible sans perturber le culot lâche.

Ré-suspendre le culot dans le SNA restant, puis transférer dans une colonne de préparation en polypropylène. Retirer les bouchons du fond de la colonne pour permettre l'écoulement du liquide par gravité. Ensuite, laver la colonne cinq fois avec 200 microlitres de tampon FC à une fois, puis procéder à la clivaison avec la TEV comme décrit dans le protocole écrit.

Après le clivage, fermez hermétiquement les extrémités supérieure et inférieure de la colonne. Mélangez délicatement le contenu de la colonne en la faisant tourner toute la nuit à quatre degrés Celsius après une rotation nocturne. Élué le liquide en retirant le bouchon supérieur et le bouchon inférieur dans la nouvelle colonne.

Lavez la colonne usagée avec 400 microlitres de tampon de liaison Cal Modlin 1 x et une suspension de 150 microlitres de billes de liaison Cal Modlin. Éluéz la protéine liée en quatre fractions de 50 microlitres dans un nouveau tube eppendorf. En utilisant un tampon d'élution Cal Modlin 1 x.

Répartir la fraction éluée en deux tubes eend orph propres en volumes égaux. Ensuite, sécher les contenus des deux tubes à l'aide d'un évaporateur sous vide. L'éluat séché provenant d'un tube est utilisé pour réaliser un gel de coloration argentée comme décrit dans le texte, tandis que l'autre est stocké à moins 80 degrés Celsius.

Pour une utilisation ultérieure en spectrométrie de masse sur l'échantillon séché, ajouter 50 microlitres de tampon de digestion et 0,9 microlitre de tris-phosphine à 100 millimolaire en acide chlorhydrique, puis incuber le mélange pendant 45 minutes à température ambiante pour l'étape de réduction. Ensuite, ajouter un microlitre d'acétamide IDO à 500 millimolaire et incuber à l'obscurité pendant 40 minutes supplémentaires afin de permettre l'alkylation de l'échantillon. Après ce second temps d'incubation, ajouter un microgramme de trips au mélange. Incuber l'échantillon soit à 37 degrés Celsius pendant cinq heures, soit toute la nuit à température ambiante après l'incubation.

Veillez à arrêter la réaction en ajoutant un microlitre d'acide acétique. Préparez ensuite la micropointe Millipore, la pipette selon les instructions décrites dans le texte pour une liaison efficace du peptide à la micropointe. Mélangez le mélange de peptides 20 fois et rincez le mélange de peptides fixé à la pointe en aspirant et en dispensant la solution de lavage.

Répétez cette procédure deux fois afin d'assurer une liaison efficace du mélange de peptides à l'embout contenant le peptide fixé. Aspirez 10 microlitres de la solution d'humidification et d'équilibrage et délivrez-les dans un nouveau tube Eppendorf propre. Répétez cette étape deux fois.

Après avoir séché les échantillons élutés dans un vide accéléré, les échantillons peuvent être analysés immédiatement par spectrométrie de masse ou stockés à moins 80 degrés Celsius avant utilisation. Les microcolonnes utilisées dans cette procédure sont remplies d'environ 10 centimètres de résine lunaire C18 de trois microns et sont connectées à une source d'ionisation électrospray nano Pro Zion placée en ligne avec l'instrument Orbitrap. Une pompe HPLC binaire à débit nano Pro Zion est utilisée pour délivrer un débit stable d'environ 300 nanolitres par minute pendant les séparations peptidiques afin d'obtenir une dilution des peptides, et de mettre en place un gradient de tampon organique en fonction de la complexité de l'échantillon.

Pour cet échantillon d'E. coli SPA, le solvant de phase mobile A contient 95 % d'eau HPLC pour gradient et 5 % d'acétonitrile avec 0,1 % d'acide formique, tandis que le solvant B contient 5 % d'eau HPLC pour gradient et 95 % d'acétonitrile avec 0,1 % d'acide formique. Après la spectrométrie de masse, rechercher les spectres à l'aide d'un algorithme de recherche dans une base de données, tel que SEQUEST, contre une base de données de séquences protéiques d'E. coli. Filtrer statistiquement les résultats à l'aide d'un algorithme de probabilité tel que STARPEP pour garantir un faible taux de découverte d'erreurs. Le facteur sigma de la polymérase ARN marqué SPA et la protéine YakLA, de fonction inconnue, co-purifient spécifiquement avec l'enzyme polymérase ARN centrale, incluant les sous-unités alpha, bêta et bêta prime, ainsi qu'avec le facteur de recyclage de la polymérase ARN. En revanche, YakL, contrairement au facteur sigma de la polymérase ARN marqué, se lie en outre à un facteur essentiel de terminaison de la transcription et d'anti-détermination, suggérant une fonction spécialisée dans la transcription.

Plusieurs autres petites protéines co-purifiées ont également été détectées par LC-MS et n'étaient pas visibles sur le gel, notamment la sous-unité Oméga de l'ARN polymérase ainsi que des facteurs de transcription, de terminaison et de détermination, USA et NUSD. Inversement, dans une expérience indépendante portant sur la machinerie de mobilisation du soufre, S-U-F-B-S-U-F-C et SUFD se sont co-purifiés mutuellement, indiquant une participation conjointe à la biosynthèse des clusters fer-soufre en tant que complexe d'échafaudage unique. Cet exemple représentatif met en évidence le fait que des complexes MultiPro bactériens bien étudiés et hautement annotés, impliqués dans des processus biologiques essentiels, possèdent souvent de nouveaux composants associés qui peuvent être efficacement identifiés.

Grâce à cette approche, le faible nombre de copies de la protéine SUFB a pu entraîner une intensité de signal faible par rapport à l'intensité forte observée lors des expériences de tirage immunologique de SUFC et SUFD, permettant de définir la composition de complexes protéiques stables formés de plusieurs unités. Des scores de co-purification ont été attribués aux interactions de haute confiance en tenant compte de l'unicité des relations appât-proie, appât-appât et proie-proie. Ensuite, à l'aide de procédures de regroupement par graphes, telles que l'algorithme de regroupement markovien, des groupes protéiques distincts ont été identifiés à partir du réseau probabiliste de PPI partitionné.

Les réseaux d'interaction putatifs peuvent être visualisés à l'aide de cyto scape. La combinaison de données de protéomique avec des preuves supplémentaires d'associations fonctionnelles déduites par des méthodes de génomique peut être utilisée pour étudier de nouveaux rôles mécanistiques des protéines e coli précédemment annotées. Ici, des sous-réseaux de complexes protéiques et de modules fonctionnels participant à des voisinages fonctionnels plus larges ont été définis chez e coli.

Le principal regroupement hiérarchique de Graham montre les profils de prédictions fonctionnelles et d'annotations existantes pour les gènes orphelins fonctionnels et caractérisés d’*E. coli* ; les couleurs jaune et bleue représentent respectivement les fonctions existantes et prédites, tandis que l’intensité des teintes reflète les scores de confiance. Les processus biologiques associés à divers voisinages sont indiqués à droite ; les encarts montrent les composants individuels d’un voisinage représentatif, basés sur les scores de similarité du réseau intégré d’interactions physiques et fonctionnelles. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière dont les complexes protéiques stables d’*E. coli* peuvent être isolés par l’approche de purification par affinité couplée à la spectrométrie de masse.

En principe, cette technique peut être appliquée pour caractériser des complexes de protéines membranaires ou des complexes protéiques provenant de n'importe quelle autre espèce, pour autant qu'ils puissent se recombiner.