Préparation standardisée des suspensions unicellulaires provenant de tissus pulmonaires de la souris en utilisant les dissociateur gentleMACS

Dans ce protocole vidéo, vous verrez comment dissocier le tissu pulmonaire de souris adulte à l’aide du système Gentle Max, après la dissociation du tissu pulmonaire. En présence de collagénase D et de DNase I, les suspensions cellulaires sont filtrées à l’aide d’un tamis cellulaire de 70 microns, centrifugées, puis mises en suspension pour des applications ultérieures. Bonjour, je suis Melanie Mlu de Miltenyi Biotec en Allemagne.

Aujourd'hui, je vais vous montrer une procédure reproductible et automatisée pour préparer une suspension de cellules uniques à partir de tissu pulmonaire de souris en utilisant la dissociation GenX. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour préparer des suspensions de cellules uniques destinées à l'obtention de leucocytes ou de cellules endothéliales. Bon, commençons.

Avant de commencer le protocole, quelques solutions standard doivent être préparées et prêtes à l'emploi. Premièrement, nous aurons besoin du tampon Hebes. Deuxièmement, une solution de collagénase D contenant 100 milligrammes par millilitre d'enzyme et du tampon hebes.

Troisièmement, une solution de dase un contenant 20 000 unités par millilitre de dase un. Enfin, deux solutions tampons courantes : un tampon PBS typique à pH 7,2 et un tampon PEB dérivé de la solution de rinçage AutoMax et de la solution mère de BSA.

Nous commençons notre protocole avec un poumon disséqué provenant d'une souris femelle de six à sept semaines, prélevée par biopsie. Veillez à ce que le poumon soit débarrassé des organes adjacents tels que le cœur et le thymus, des vaisseaux sanguins efférents et afférents, de la trachée et des tissus conjonctifs. Rincez le tissu dans une boîte de Pétri contenant du PBS afin d'éliminer les érythrocytes.

Typiquement, un poumon de souris à cet âge pèse entre 110 et 150 milligrammes. Si vous prévoyez d'associer des poumons provenant d'animaux plus âgés ou d'autres souches de souris, pesez le tissu et le tampon. Un maximum de 450 milligrammes de tissu peut être dissocié par tube.

Transférez le tissu pulmonaire dans un tube C max doux chargé avec 4,9 millilitres de tampon heis. Ajoutez 100 microlitres de solution de collagénase D pour obtenir une concentration finale de deux milligrammes par millilitre dans le tissu pulmonaire et le tampon. Maintenant, 10 microlitres de dase.

Une solution pour plus de 150 milligrammes de tissu. Ajouter 20 microlitres de la solution dase une. S'assurer que le tube C est bien fermé et le placer à l'envers sur le gentle max dis.

Veillez à ce que le tissu soit positionné entre le rotor et le stator. Sélectionnez le programme pour poumon et lancez-le en appuyant sur le bouton de démarrage. À la fin du programme, retirez le tube C de l'appareil et incubez l'échantillon pendant 30 minutes.

Dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant l'incubation, le tube doit être agité à l'aide d'un agitateur rotatif max ou retourné manuellement toutes les cinq minutes. Après l'incubation, remettez le tube C dans l'associateur doux max et lancez le deuxième programme pour poumon. Pendant l'exécution du programme, préparez un tube de 50 millilitres pour recueillir les cellules filtrées en remplaçant le bouchon par un tamis cellulaire de 70 micromètres. Une fois le programme de dissociation terminé, selon la répartition du matériel échantillon dans le tube, vous pouvez souhaiter centrifuger brièvement le tube afin de concentrer le matériel échantillon.

Les cellules dissociées peuvent être prélevées du tube par pipetage à travers le bouchon scellé à septum du tube C. À l’aide d’une pointe de pipette adaptée de 1000 microlitres, la suspension cellulaire est appliquée sur le filtre à cellules afin d’éliminer les particules ou agrégats plus gros. Une fois la solution écoulée, laver le filtre à cellules en ajoutant cinq millilitres supplémentaires de tampon hees à température ambiante pour former le culot des cellules filtrées.

Centrifuger le tube de 50 millilitres à 300 ×g pendant 10 minutes. Aspirer ensuite le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans le volume désiré de tampon PEB à température ambiante.

Ne pas décanté le surnageant. Vous pouvez maintenant passer à votre application en aval. La dissociation du tissu pulmonaire de souris à l'aide de cette procédure permettra d'obtenir un pourcentage élevé de leucocytes et de cellules endothéliales viables.

Les suspensions uniques de cellules obtenues ont été marquées avec CD 45 PE, CD 1 46 FITC ou CD 31 FITC, puis analysées par cytométrie en flux. Ce graphique illustre l'enrichissement des cellules dendritiques à l'aide de microbilles CD 11 C, d'un séparateur minimax et de deux colonnes MS. J'ai donc montré comment préparer de manière standardisée des suspensions uniques de cellules à partir de tissu pulmonaire de souris, en utilisant la dissociation douce avec des tubes C.

Cette méthode permet la dissociation efficace et gén des tissus. Lors de cette procédure, il est important de disséquer correctement le poumon et de traiter le tissu immédiatement après la dissection. Les suspensions monocellulaires préparées peuvent ensuite être utilisées pour des expériences ultérieures.

Par exemple, le marquage magnétique des cellules, puis la séparation des leucocytes ou des cellules endothéliales. Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.