La production de lentivirus

Cette procédure commence par la transfection de cellules 293T avec un lentivirus, un plasmide et des vecteurs d’emballage viral ; le surnageant viral est récolté après une période d’incubation d’au moins 48 heures. Le surnageant est filtré puis concentré à l’aide d’une ultracentrifugation. Le culot viral est mis en suspension dans du PBS afin d’obtenir le titre viral : diluez d’abord le virus concentré dans un milieu complet, puis effectuez une dilution en série pour infecter les cellules avec le lentivirus.

Bonjour, je suis Shein Wong du laboratoire de Michael McManus au centre du diabète de l'Université de Californie à San Francisco. Je suis Michael McManus. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure pour la production de lentivirus.

Nous utilisons cette procédure en laboratoire pour produire des lentivirus destinés à l'interférence ARN. Commençons donc. Pour commencer ce protocole, préparez l'ADN permettant de transfecter les cellules 2 9 3 T.

Diluez d'abord le réactif de transfection FU gene six dans un tube de 1,5 millilitre en mélangeant 30 microlitres de Fuji six avec 600 microlitres de milieu sans sérum. Veillez à ne pas laisser le Fuji toucher les parois du tube lors de son ajout dans le milieu. Incubez à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, dans le bouchon du tube, mélangez quatre microgrammes de plasmide lentiviral avec 1,33 microgrammes.

Chaque vecteur d’emballage viral de troisième génération. Le plasmide lentiviral contient l'ADN. Le virus s'insérera dans le génome de chaque cellule qu'il infecte, tandis que les vecteurs d’emballage contiennent les gènes de toutes les autres protéines nécessaires à la fabrication d’un virus lentiviral. Fermez le couvercle et mélangez en retournant le tube plusieurs fois.

Incubez l'ADN et le réactif de transfection de 15 à 20 minutes à température ambiante. Il est maintenant temps de transfecter les cellules 2 9 3 avec l'ADN que vous avez préparé : utilisez des cellules que vous avez ensemencées 24 heures auparavant et qui ont atteint une confluence de 50 à 70 % ; dans la hotte de culture cellulaire, pipetez tout l'ADN préparé sur la plaque contenant les cellules 2 9 3, puis mélangez délicatement en inclinant la plaque d'avant en arrière. Replacez les cellules dans l'incubateur et laissez la production virale se poursuivre pendant 48 à 96 heures avant la récolte. Pendant l'incubation, les cellules 2 9 3 produisent des lentivirus dont les génomes contiennent une copie ARN de votre ADN d'intérêt.

Il est maintenant temps de recueillir le virus. Sortez vos cellules de l’incubateur. Préparez dans la hotte de culture cellulaire un filtre à seringue de 0,4 ou cinq micromètres, une seringue jetable de 10 millilitres et un tube d’ultracentrifugation UltraClear Beckman.

Utilisez la seringue jetable pour prélever le surnageant, qui contient désormais le virus. Fixez un filtre à seringue de 0,45 micron à l'extrémité et filtrez le virus dans un tube à centrifuger UltraClear Beckman. Le filtre permet uniquement aux virus, et non aux cellules, de passer avant de jeter les cellules productrices de virus, qui doivent être incubées.

Placer les plaques de culture, les seringues et les filtres dans une solution d'eau de javel à 10 % pendant 45 minutes. Maintenant que vous avez collecté et filtré le virus, il est temps de concentrer le virus par ultracentrifugation. Utilisez du DMEM sans sérum pour équilibrer tous les tubes contenant le virus à ± 0,2 gramme près les uns des autres.

Ensuite, chargez les tubes de centrifugeuse équilibrés dans les godets du rotor SW 41 TI ou SW 28. Fermez hermétiquement les godets du rotor et accrochez-les au rotor. Puis placez le rotor à l'intérieur de l'ultracentrifugeuse.

Faire centrifuger le virus pendant environ 90 minutes à quatre degrés Celsius à 25 000 tr/min dans un rotor SW 41 TI, ou à 24 000 tr/min dans un rotor SW 28. Après la centrifugation, retourner dans la hotte de culture tissulaire et retourner le tube pour verser le surnageant dans un récipient contenant de l’eau de Javel à 10 %. Utiliser un essuie-tout Kim pour absorber le liquide excédentaire autour du culot, puis placer le tube à l’envers dans un support adapté pendant pas plus de cinq minutes, jusqu’à ce que vous soyez prêt à resuspendre le culot.

Pour resuspendre le culot viral, utilisez une pointe filtrante pour ajouter 100 microlitres de PBS stérile préfiltré à votre tube. Ensuite, pipetez vers le haut et vers le bas environ 20 fois. Laissez le virus à quatre degrés toute la nuit pour terminer la resuspension.

Vous pouvez conserver les préparations virales à quatre degrés pendant environ une semaine et à moins 80 degrés pendant jusqu'à un an. N'oubliez pas de traiter tous les tubes vides avec de l'eau de javel à 10 % avant de les jeter. Si vous prévoyez d'utiliser la préparation virale pendant plus d'une semaine, elle se conserve au réfrigérateur.

Prélevez des aliquotes minimales de cinq à 20 microlitres pour les expériences futures et une aliquote de trois à cinq microlitres pour la titration, puis congélez et stockez les aliquotes à environ moins 80. L'étape suivante consiste à déterminer le titre viral. Si vous avez inclus un gène rapporteur fluorescent dans votre plasmide lentiviral, les cellules infectées fluoresceront et vous pourrez déterminer le titre viral par cytométrie en flux.

Pour commencer, diluez trois microlitres de virus concentré dans 1,5 millilitre de milieu complet dans les puits numérotés de un à six, disposés sur une seule rangée d'une plaque de 96 puits. Effectuez les dilutions sérielles suivantes dans les six puits avec 100 microlitres de DM complet. Au premier puits, ajoutez 100 microlitres de milieu sans virus.

Il s'agit de votre témoin non coloré. Ajoutez 100 microlitres du virus dilué à la troisième cavité. Ajoutez 100 microlitres du mélange provenant de la deuxième cavité à la quatrième.

On ajoute 100 microlitres du troisième puits au cinquième. On ajoute 100 microlitres du quatrième puits au sixième. On ajoute 100 microlitres du cinquième puits.

Prélève finalement 100 microlitres à partir du sixième puits et jette-les, puis ajoute de l'eau de Javel pour ramener le volume total dans tous les puits à 200 microlitres avec du DMEM. À chaque dilution, la concentration virale diminue de moitié. Remarque : il s'agit uniquement de dilutions suggérées, qui conviennent bien pour la titration de la plupart des virus concentrés.

Si votre virus présente un faible titre ou n'est pas concentré, vous devrez peut-être ajuster vos dilutions. Traitez tout virus dilué inutilisé avec de l'eau de javel à 10 % pendant 45 minutes avant de le jeter dans un contenant pour déchets biologiques dangereux. Ajoutez environ 15 000 cellules 293T saines et en division active à chacun des six puits.

Vous pouvez utiliser une seule plaque de 96 puits pour titrer 16 préparations virales, compléter les milieux jusqu'à 200 microlitres, replacer les cellules dans l'incubateur et laisser l'infection se dérouler pendant au moins 48 heures. Après l'incubation, analyser la fluorescence des cellules à l'aide d'un cytomètre en flux. Vous pouvez utiliser le pourcentage de cellules fluorescentes par puits pour déterminer le titre ou le nombre de particules virales infectieuses par millilitre de virus ajouté.

Calculez le nombre d'unités infectieuses par millilitre à l'aide de la formule suivante lors de l'interprétation des résultats du cytomètre en flux. Notez qu'il est possible d'obtenir des calculs précis du titre uniquement lorsque les cellules infectées ont reçu au maximum une intégration virale par cellule.

Pour s'assurer que tel est le cas, utilisez des cellules présentant un taux d'infection inférieur à 15 % pour les calculs. Les cellules ayant des taux d'infection plus élevés auront probablement reçu plusieurs intégrations virales par cellule. La dilution suggérée à l'étape deux devrait produire plusieurs échantillons dans cette fourchette d'infection.

Utilisez idéalement plusieurs échantillons pour générer une courbe de titrage à partir de laquelle vous pouvez calculer le titre final. La formule calculée à partir de la droite linéaire ajustée peut être utilisée pour déterminer le titre viral, mais vous pouvez calculer le titre à l’aide d’un seul échantillon si nécessaire. On peut s’attendre à un titre de un fois dix puissance sept unités de transduction par millilitre pour le virus non concentré, et de un fois dix puissance huit unités de transduction par millilitre pour le virus concentré.

Nous venons de vous montrer comment produire des lentivirus lors de cette procédure. Il est important de respecter toutes les réglementations de biosécurité et d'éliminer les déchets de manière appropriée. Voilà, c'est terminé.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.