Emballage VIH ou FIV à base de constructions d'expression et de transduction du Lentivector VSV-G pseudotypés particules virales

L'objectif général de cette procédure est d'apprendre la production de lentivirus. Un protocole de cinq jours. Le premier jour, les cellules productrices 2 9 3 TN sont semées à une densité calculée.

Le deuxième jour, les cellules sont transfectées avec le construct de vecteur lentiviral choisi, contenant le gène d'intérêt, ainsi qu'avec le mélange de plasmides d'emballage viral. Le quatrième jour, le surnageant viral est récolté et concentré en ajoutant une solution de précipitation virale au PEG. Les étapes finales de la procédure consistent à récolter le virus concentré au PEG, à aliquoter le virus et à infecter des cellules avec le virus concentré afin d'en déterminer la titration virale.

En fin de compte, la PCR quantitative de gènes intégrés de manière stable est utilisée pour calculer le nombre de constructions intégrées de façon stable. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la transfection par plasmide ou la transduction rétrovirale, est que le protocole d’emballage de lentivirus optimisé par FBI produit un virus fonctionnellement actif à haut titre, permettant une livraison efficace dans presque toutes les cellules mammaliennes, y compris les cellules difficiles à transfecter comme les cellules souches et les cellules primaires non divisantes. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés car elles ne sont pas familières avec les petits détails du protocole, qui sont essentiels pour une production réussie de virus à haut titre.

La démonstration visuelle de cette méthode est utile, car la densité cellulaire observée au microscope pendant la transfection détermine l'efficacité de l'empaquetage viral, laquelle influence la concentration finale du virus. Dans les cas où l'expression d'un marqueur rapporteur fluorescent détermine l'efficacité de la transfection, celle-ci a un impact significatif sur la concentration finale du virus. De plus, la démonstration visuelle de cette méthode aide les chercheurs à se familiariser avec des étapes subtiles mais importantes du protocole, telles que les bonnes pratiques pour maintenir la stérilité tout au long du processus, ainsi que la manière d'éviter d'inclure des débris cellulaires dans le virus récolté.

L’emballage efficace des lentiviraux repose sur trois composants. Premièrement, le vecteur d’expression lentiviral doit contenir certains éléments requis pour l’encapsidation du virus et l’intégration stable, ainsi que des éléments permettant l’expression du gène d’intérêt, tels qu’un court ARN en épingle à cheveux, un ARN micro, ou une cassette rapporteuse.

Deuxièmement, les plasmides d’emballage lentiviraux doivent fournir les protéines essentielles à l’encapsidation d’une copie ARN du vecteur d’expression dans des particules pseudovirales recombinantes, ainsi qu’à la transcription inverse et à l’intégration virale ultérieures lors de l’infection. Troisièmement, les cellules productrices 293TN doivent être cotransfectées de façon transitoire avec les vecteurs d’expression et d’emballage. Ces cellules produisent des particules pseudovirales à haut titre, qui sont ensuite récupérées à partir du milieu de culture.

En fin de compte, la transduction réussie des cellules cibles dépend principalement du nombre de particules virales par cellule pour un type cellulaire donné. Autrement dit, la multiplicité d'infection commence par la culture de cellules 293TN dans des plaques de culture cellulaire de 15 centimètres pendant 18 à 24 heures afin d'obtenir une confluence de 60 à 80 %.

Au moment de la transfection, chaque plaque fournira environ 14 millions de cellules afin d'augmenter le rendement viral. Plus d'une plaque peut être utilisée le jour suivant, lorsque les cellules 293TN atteignent une confluence de 60 à 80 %, elles sont alors prêtes pour la transfection. Pour chaque plaque de cellules, ajouter 1,6 millilitre de DMEM sans sérum dans un tube conique de 15 millilitres.

Ensuite, ajoutez 22,5 microgrammes de ppac H1 ou de Ppac F1 et 4,5 microgrammes de votre construction vectorielle lenti au DMEM et mélangez par aspiration et expulsion à l’aide d’une pipette. Ajoutez ensuite 55 microlitres de pure affection dans le même tube et vortexez pendant 10 secondes, puis incubez 15 minutes à température ambiante. Après 15 minutes, ajoutez le contenu d’un tube dans chaque plaque de culture.

Ajoutez goutte à goutte puis mélangez délicatement la plaque, puis incubez les cellules pendant 48 heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone après 48 heures. Si le vecteur lentiviral exprime un gène fluorescent comme GFP, observez les cellules au microscope ; une transfection réussie donnera de 50 à plus de 90 % de cellules vertes fluorescentes. Récoltez maintenant le surnageant du milieu de culture cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres. Le surnageant contient les particules pseudovirales infectieuses.

Toute cellule détachée de la plaque n'aura pas d'effet négatif sur la production de virus. Pour éliminer les débris, centrifuger le surnageant viral à 1500 G pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, sans perturber le culot, récupérer le surnageant viral en veillant à laisser un tampon d'environ 500 microlitres de surnageant, puis passer à l'étape suivante, qui consiste à concentrer les particules virales 72 heures après la transfection.

Une deuxième collecte facultative du surnageant viral peut être effectuée en utilisant la même technique après la collecte de l'état viral. Concentrer en ajoutant un volume de solution de précipitation virale PEG glacée à quatre volumes de surnageant dans un tube à centrifuger polypropylène de 50 millilitres. Inverser le tube pour homogénéiser la solution.

Ne jamais utiliser de vortex, puis conserver la solution sans agitation à quatre degrés Celsius pendant un maximum de 96 heures. Après un minimum de 12 heures de réfrigération, centrifuger le mélange à 1500 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, les particules lentivirales précipitées avec du PEG apparaîtront comme un culot beige ou blanc au fond du tube.

Maintenant, éliminez toutes les traces de liquide par aspiration soigneuse sans perturber les particules lentivirales précipitées dans le culot. Alternativement, retirez la majeure partie du surnageant et resuspendez le culot dans le surnageant restant. Transférez ensuite la suspension dans un tube Eppendorf stérile de deux millilitres et centrifugez le tube dans une microcentrifugeuse froide pendant deux minutes.

À 14 000 tr/min, prélevez le surnageant restant à l’aide d’une pipette et resuspendez le culot de particules lentivirales dans un tampon stérile froid sur glace, à un volume compris entre un dixième et un centième du volume initial. Prélevez délicatement le culot avec la pipette pour l’introduire en solution, sans former de bulles, et maintenez-le constamment au froid. Veillez à ce que le culot soit complètement resuspendu.

Enfin, préparer des aliquotes de 15 à 25 microlitres d'encre dans des tubes cryogéniques stériles sur de la glace et conserver les tubes à moins 70 degrés Celsius. Une opération d'emballage réussie permettra d'obtenir de 10 millions à 1000 millions d'UIF par millilitre pour la transduction virale dans une plaque de culture à 24 puits, avec 50 000 cellules par puits, et les faire croître toute la nuit dans leurs conditions de culture spécifiées. Les cellules doivent présenter une confluence comprise entre 50 et 70 % pour la transduction à des fins de titrage.

Les cellules HT 10 80 peuvent être utilisées comme ligne cellulaire témoin facile à transduire. Le jour suivant, aspirez le milieu des cellules. Ensuite, mélangez le milieu de culture avec la solution concentrée de transducteurs. Ainsi, la concentration finale de transducteurs est de 1 x ; ajoutez 0,5 millilitre de la solution transduite à chaque puits contenant les cellules cibles à la densité appropriée de 50 à 70 % de confluence. Ajoutez le virus à chaque puits selon les dilutions suivantes : 1/100, 1/10 et une dilution directe 1/1.

Le virus peut rester en contact avec les cellules cibles jusqu'à 72 heures sans changement de milieu. Après 72 heures, le provirus sera intégré de façon stable dans le génome de l'hôte et exprimera le gène d'intérêt. Si un marqueur fluorescent est présent, son expression peut être utilisée pour estimer l'efficacité de transduction avec différentes dilutions du virus, puis le nombre d'unités infectieuses peut être quantifié par QPCR.

Une fois le titre viral connu, calculez le volume approprié de virus nécessaire pour atteindre la multiplicité d'infection souhaitée pour d'autres cellules cibles. La mesure du titre et le contrôle du MOI garantissent une cohérence entre les expériences et différentes préparations virales. Le virus est désormais prêt à être utilisé dans des expériences supplémentaires.

La densité initiale des cellules 2 9 3 TN était cruciale pour un emballage viral réussi le jour de la transfection. Ces cellules 2 9 3 TN présentaient une confluence comprise entre 60 et 80 %. Vingt-quatre heures après une transfection réussie avec un vecteur lentiviral exprimant la GFP, on a observé que plus de 90 % des cellules 2 9 3 TN présentaient une fluorescence verte.

72 heures après la transduction, la GFP continuait à s'exprimer dans les cellules hôtes HT 10 80. Cela indique que le vecteur lentiviral s'est intégré de manière stable dans le génome hôte. La transduction des mêmes cellules hôtes à une dilution dix fois moindre a réduit proportionnellement l'expression de la GFP. En effet, la relation entre le titre viral et l'expression génique médiée par le lentivirus est directement proportionnelle.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq jours environ, avec une durée d'une à deux heures par jour, à condition d'être exécutée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'emballer efficacement et en toute sécurité des particules virales fonctionnellement infectieuses, ainsi que de transduire avec succès des cellules à l'aide du virus. N'oubliez pas que le travail avec le lentivirus peut présenter des risques, et que des précautions doivent être prises, comme travailler sous une hotte de culture cellulaire de niveau BSL 2.

Le port d'une blouse de laboratoire et de gants doit toujours être pris en compte lors de l'exécution de cette procédure.