Mésoscopique fluorescence tomographie pour In vivo L'imagerie du développement Drosophile

Afin de réaliser les reconstructions d'organes en développement chez Drosophila melanogaster, nous devons déterminer le modèle direct qui décrit le mieux la propagation de la lumière à l'intérieur de la pupe elle-même. La procédure commence par la sélection d'une pré-pupe blanche, que l'on colle à l'extrémité d'un tube capillaire de manière à orienter l'axe antéro-postérieur de la pupe parallèlement au tube. Un petit tube capillaire rempli d'un colorant fluorescent est inséré dans l'enveloppe pupale.

Après un réglage minutieux des axes, la nymphe est tournée de 360 degrés. Des images sont acquises selon différents angles. Les données d'illumination transversale fluorescente acquises sont utilisées pour déterminer le modèle direct qui sera employé pour imager le développement des organes.

Bonjour, je m'appelle Claudia et je travaille au Centre d'assistance en biologie du Massachusetts General Hospital, de la Harvard Medical School. Je suis Ula Petou du laboratoire Paramount de la Harvard Medical School, et je suis Daniel Rozanski de l'Institut d'imagerie biologique et médicale de l'Université technique de Munich et du centre Heliman Munich. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de reconstruction tridimensionnelle de l'organisme entier chez Oph Melano Casta.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour la visualisation in vivo du développement des organes au cours du statut pupillaire. Commençons donc. Avant de commencer, veuillez noter qu'il existe une vidéo accompagnante qui doit être visionnée avant celle-ci, dans laquelle certains aspects techniques de la tomographie par projection optique sont expliqués de manière plus détaillée que dans ce document.

En outre, l'autre vidéo explique l'imagerie de tissus ou d'organes préparés provenant d'animaux plus grands. Pour toutes les expériences abordées dans cette vidéo, des transgènes de drosophile forgés seront utilisés. Il s'agit du gal quatre EL A exprimé dans les glandes salivaires, du gal quatre apteris, qui est exprimé dans les tissus précurseurs larvaires de l'aile et du thorax adulte, ainsi que du transgène produisant une protéine fluorescente.

En réponse à Gal quatre appelé U-A-S-G-F-P et blanc 1118, les mâles contrôles non fluorescents porteurs des transgènes UAS sont croisés avec des femelles vierges portant les transgènes GAL quatre pour obtenir une expression tissulaire spécifique de la GFP. Les croisements sont mis en place à partir de huit à dix femelles vierges et de mâles sur un milieu standard pour drosophiles, enrichi d'une pincée de levure de boulanger. Ensuite, les flacons sont conservés à 25 degrés Celsius dans un incubateur humidifié soumis à un cycle lumineux de 12 heures claires et 12 heures sombres.

Deux jours après le début du croisement, les parents sont transférés dans un nouveau flacon, et cinq à six jours plus tard, les pré-PUi commencent à coloniser le flacon. Les individus exprimant GFP sont sélectionnés au microscope stéréo fluorescent. La sélection des pré-PUi blancs garantit un bon étalonnage des animaux, car ils restent blancs pendant environ une heure.

Après la différenciation pupale, ils deviennent pigmentés ou brunâtres. Les pupes exprimant la GFP sont délicatement prélevées des flacons à l’aide d’un pinceau humide et placées dans une goutte d’eau ou de PBS dans une boîte de Pétri, mais doivent être débarrassées de tout matériau autofluorescent. À l’aide du pinceau, elles doivent désormais être prêtes pour l’imagerie tomographique.

Si les PrepU doivent continuer à vieillir pour atteindre le stade de développement approprié, ils peuvent être conservés dans une boîte de Pétri avec une serviette en papier humide ou dans un flacon propre contenant de la nourriture. Cela garantira une humidité suffisante et un développement adéquat en vue de l'imagerie. Les PrepU doivent être fixés à l'intérieur d'un tube capillaire en verre de 800 microns de diamètre.

Peindre l'extrémité postérieure de la pupille avec de la colle superglue, puis orienter la surface collée de la prépupille dans le tube de manière à ce que l'axe antéro-postérieur de la mouche soit parallèle au tube. La partie antérieure de l'animal dépassera du tube capillaire. Le tube capillaire est désormais fixé sur le plateau rotatif du microscope.

En position verticale, ajuster l'axe d'inclinaison de la platine rotative de manière à ce que l'axe de rotation du tube soit parallèle aux colonnes de pixels du CCD d'imagerie. Une fois la position de la drosophile affinée, procéder à l'acquisition d'images. Dans cet exemple, des animaux possédant des glandes salivaires fluorescentes doivent être imagés afin que des individus exprimant la GFP dans leurs glandes salivaires puissent être obtenus par croisement entre des lignées EAG four et U-A-S-G-F-P.

Nous commençons avec une prépupée montée, que nous éclairons à l'aide d'un faisceau d'excitation et capturons le signal fluorescent GFP. En transillumination, faites pivoter le montage de 360 degrés autour de son axe vertical et acquérez les images en transillumination. Chaque image correspond à une rotation de 10 degrés.

Le temps total d'acquisition dépend de la quantité de fluorescence et de l'intensité du faisceau d'excitation. Les durées typiques sont de l'ordre d'une minute. Dans cet exemple, une nymphe de DSO exprimant la GFP dans les disques imaginaux des ailes sera imagée.

Cette nymphe peut être collectée à partir d’un flacon contenant un croisement entre les lignées Aus GAL quatre et U-A-S-G-F-P. La pré-nymphe est montée comme décrit précédemment. Toutefois, étant donné que le temps d’imagerie pour cette expérience est d’environ huit heures, il est essentiel que l’environnement reste humide et à température ambiante afin d’éviter la déshydratation et la mort de l’animal. Un obturateur est placé au-dessus du faisceau d’excitation afin d’empêcher l’extinction des floral fours dans le tissu d’intérêt, ainsi que de garantir que l’animal ne soit pas brûlé par le faisceau laser. Comme auparavant, on illumine à l’aide du faisceau d’excitation et on recueille le signal fluorescent de la GFP par illumination transversale.

La prépupaire est complètement tournée autour de son axe vertical. Pendant la collecte des données, la rotation ne prend qu'une minute et est répétée à différents intervalles de temps. Pour créer une série d'images en accéléré des ailes pendant leur développement, les données peuvent être acquises pendant au moins six heures à raison de 100 images par heure.

Il est essentiel de contrôler l'exposition totale à la lumière à l'aide de cet obturateur afin d'éviter tout dommage ou photoblanchiment. Ce film montre des images acquises entre l'étape PrepU et l'évitement de la tête par la pupille. Lors de la reconstruction de l'image tridimensionnelle, il existe une forte diffusion vers l'avant qui doit être prise en compte et qui ne peut pas être approchée par une diffusion simple.

Ainsi, pour effectuer la reconstruction, un modèle de diffusion avant de la propagation de la lumière doit être déterminé. Par souci de simplicité, nous négligeons l'absorption. La quantité de diffusion est mesurée expérimentalement. Pour ce faire, un objet étranger présentant une fluorescence normalisée est inséré dans une pré-nymphose blanche non fluorescente de souche 1118, puis analysé afin de générer les données du modèle direct. Commencez par remplir un tube capillaire en silice de 100 micromètres avec le colorant fluorescent PS 5,5.

À l’aide de l’action capillaire, insérez le tube capillaire dans la nymphe selon un angle de 45 degrés par rapport à l’axe antérieur, montez le PrepU dans un tube capillaire et positionnez-le correctement sur la platine tournante comme décrit précédemment. Illuminez maintenant la pré-nymphe avec un faisceau laser d’excitation à l’aide d’un objectif à faible ouverture numérique et recueillez des images en trans-illumination fluorescente de la pré-nymphe. Comme décrit précédemment, le logiciel MATLAB est utilisé pour ajuster les données à un modèle théorique direct explicite. Pour faciliter le processus de reconstruction, l’approximation de diffusion à diffusion faible (« firm e approximation ») de l’équation de transport est choisie, car elle décrit le régime de diffusion vers l’avant et s’ajuste également aux données expérimentales.

Après avoir déterminé le modèle direct approprié, nous pouvons reconstruire les glandes salivaires et obtenir des reconstructions tomographiques en laps de temps. Si vous prévoyez d'utiliser une tomographie en espace libre, des algorithmes de configuration pour l'ajustement d'indice peuvent également être mis en place. Premièrement, nous présentons une reconstruction 3D des glandes salivaires au début du développement.

Pour comparaison, la coloration histologique des glandes salivaires montre que les reconstructions correspondent bien à l'histologie. Ce film en accéléré du développement des disques imaginaux des ailes a été obtenu à partir d'un unique spécimen vivant. Pour comparaison, la coloration histologique du disque d'aile aux mêmes points temporels montre que les reconstructions correspondent bien à l'histologie.

Nous venons de vous montrer comment construire un système permettant d'imaginer des structures tridimensionnelles au sein de l'oph in vivo, et dans le temps. Cela nous permet de suivre la morphogenèse chez Drosophila, ainsi que le développement des ailes sur six heures consécutives. Lors de cette procédure, il est essentiel de choisir le modèle direct approprié pour la propagation de la lumière au sein de Drosophila.

Cette méthode peut être utilisée en combinaison avec des techniques histologiques pour éclairer le développement d'organes au cours des stades oph pupillaires, et elle peut être modifiée pour l'étude d'organismes différents de taille similaire. Voilà donc tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.