Assay anneau aortique

L'objectif général du test de l'anneau aortique est de fournir un système expérimental souple dans lequel des vaisseaux sanguins sont formés à partir de fragments entiers d'aorte de souris au sein d'une matrice tridimensionnelle. Cela est réalisé en disséquant d'abord l'aorte thoracique d'une souris, puis en la nettoyant soigneusement de tout tissu résiduel environnant. Des tranches d'aorte propre, ou anneaux aortiques, sont placées dans des puits individuels d'une plaque de 48 puits contenant chacun un extrait de matrice basale ou BME moulé en dômes.

Une goutte supplémentaire de BME entoure l'anneau dans une structure tridimensionnelle. La matrice peut contenir tout réactif expérimental choisi. Après une incubation de plusieurs jours, on peut observer la formation de vaisseaux à partir des anneaux aortiques et évaluer le potentiel angiogénique des composés testés.

Bonjour, je suis Karen Bein du laboratoire du Dr E. Lewis, du Département de biochimie clinique de l'Université Beon de la Négative à Be Sheva, en Israël. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'essai sur des anneaux aortiques de souris. Nous utilisons cette méthode dans notre laboratoire pour étudier les effets de divers matériaux sur la formation des vaisseaux sanguins.

Commençons. Pour commencer cette procédure, laissez l'extrait de matrice basale ou BME décongeler sur de la glace ou à quatre degrés Celsius. Une fois décongelé, maintenez le BME au froid afin d'empêcher sa re-solubilisation.

Le jour de l'expérience, euthanasier une souris âgée de six à sept semaines par une injection standard de kétamine et de xylazine, suivie d'un saignement rapide par les artères du cou, puis d'une dislocation cervicale. Commencer la procédure en essuyant l'animal avec de l'éthanol à 70 % dans une hotte à flux laminaire stérile. Ensuite, tout en travaillant sous un microscope stéréoscopique, utiliser des pinces stériles et des ciseaux de dissection pour pratiquer une incision verticale de la peau et ouvrir la paroi péritonéale.

L'incision doit être réalisée afin d'exposer le sternum supérieur, là où la cage thoracique est également coupée et le diaphragme retiré. Procéder ensuite à repousser soigneusement tous les organes sur le côté, en exposant complètement l'aorte thoracique située le long de la colonne vertébrale. Une fois l'aorte exposée, insérer une pince stérile fine entre l'aorte et la colonne vertébrale. Écarter doucement les branches de la pince et soulever progressivement l'aorte de son lit, en dissociant le segment thoracique du reste de l'aorte.

Maintenant que l'aorte est séparée, utilisez des ciseaux pointus pour la détacher de la souris en partant de l'extrémité située à proximité des vaisseaux rénaux et en terminant près du cœur. Placez l'aorte thoracique excisée dans une boîte de Pétri remplie de PBS stérile et froid. Maintenant que l'aorte est retirée, les anneaux aortiques peuvent être préparés à l’aide de deux paires de pinces stériles, en travaillant sous un microscope stéréoscopique.

Nettoyer l'aorte thoracique en éliminant les tissus adipeux environnants. Veiller à ne pas endommager l'aorte et à la manipuler uniquement par les bords. L'aorte doit être plongée à plusieurs reprises dans la boîte de Pétri contenant du PBS afin d'éviter la déshydratation jusqu'à ce qu'elle soit complètement nettoyée.

Maintenant que l'aorte thoracique est propre, utilisez une lame chirurgicale et travaillez sous la loupe binoculaire pour découper l'aorte uniformément en anneaux d'un millimètre. En utilisant une règle placée sous la surface de coupe comme guide, veillez à utiliser une lame neuve et à la remplacer régulièrement afin de conserver son tranchant. Les extrémités de l'aorte ne sont pas utilisées. Après avoir découpé chaque anneau, utilisez une pince pour le transférer très délicatement dans une nouvelle boîte contenant du PBS froid.

Placer tous les anneaux dans la même plaque contenant du PBS afin d'assurer une randomisation du test. Étant donné que chaque segment de l'aorte possède un potentiel angiogénique légèrement différent, maintenir les anneaux sur de la glace. Ensuite, préparer la plaque de test à l'aide de pointes de pipette prérefroidies.

Ajouter dans chaque puits d'une plaque de 48 puits une goutte d'environ 150 microlitres de BME froid ; la goutte se solidifie en une coupole durant son dépôt. Le BME permet le transport de substances, la chimiotaxie cellulaire, et surtout, la différenciation et la migration cellulaires conduisant à la formation de nouveaux vaisseaux. Les puits périphériques sont remplis de PBS afin d'éviter la déshydratation du BME. Laisser la goutte de BME se solidifier à 37 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes. Une fois le BME solidifié, prélever délicatement un anneau aortique depuis la boîte de Pétri à l’aide de pinces, afin d’éviter tout dommage ; l’anneau doit être transféré à l’intérieur de la goutte de liquide qui se forme entre les extrémités des pinces. En raison de la tension superficielle du liquide, placer un seul anneau aortique au centre supérieur de chaque coupole, puis incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Ajouter ensuite, au-dessus de chaque anneau, 150 microlitres supplémentaires de BME et incuber pendant 20 à 30 minutes.

À 37 degrés Celsius, l'anneau est désormais inclus dans le BME et le test. Des matériaux peuvent être ajoutés à la plaque pour initier le test. Complétez le milieu sérum libre pour cellules endothéliales humaines préparé précédemment avec soit le matériau expérimental, soit un supplément de croissance pour cellules endothéliales en tant que contrôle positif, ou un contrôle négatif.

Utilisez uniquement le milieu. Ajoutez 500 microlitres de milieu supplémenté avec le pres à chaque puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant six à douze jours. Pendant cette période d'incubation, examinez la plaque au microscope et recherchez les vaisseaux qui germent à partir de l'aorte ainsi que les vaisseaux matures avancés identifiés par des ramifications supplémentaires.

Doit s'étendre tridimensionnellement à partir du tissu en anneau ; photographier les anneaux entre le jour 6 et le jour 12 au stéréomicroscope standard en contraste de phase. En outre, recueillir les surnageants à différents jours compris entre le jour 6 et le jour 12, et les conserver à quatre degrés pour une utilisation dans les 24 heures, ou à moins 20 ou moins 80 pour une utilisation ultérieure. Les surnageants peuvent être analysés par diverses techniques telles que Elisa pour VGF ou dosage Griess pour les concentrations d'oxyde nitrique.

Ces images ont été recueillies 12 jours après le positionnement des anneaux dans les puits et leur incubation soit avec le milieu de culture, visible sur la rangée supérieure des images, soit avec l'ECGS utilisé comme témoin positif de la formation de bourgeons vasculaires, comme indiqué dans le panneau inférieur. Chaque image représente une vue typique parmi quatre des douze anneaux, ce qui est habituellement utilisé dans le test par condition.

L'angle de chaque anneau aortique dans chaque puits séparé est noir. Lorsqu'ils sont photographiés ainsi, les anneaux aortiques exposés aux ECGS présentent une croissance vasculaire, et les flèches indiquent plusieurs des nombreux vaisseaux formés. Chaque vaisseau se caractérise par des chaînes de cellules endothéliales avec des branchements occasionnels, signe qu'ils sont matures.

Aucun vaisseau en germination ne peut être observé dans la culture. Puits de milieu dans le panneau supérieur, nous venons de vous montrer comment réaliser le test de l'aorte coréenne lors de cette procédure. Il est important de se rappeler de travailler avec précision et de comprendre leurs conditions.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.