La transgénèse Zebrafish Mosaic pour évaluer des séquences Enhancer

Bonjour, je suis Erica Kgi du laboratoire de Shannon Fisher, Département de biologie cellulaire et du développement à l'Université de Pennsylvanie. Je suis Chris Weber, également du laboratoire Fisher. Et je suis Shannon Fisher.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant d'analyser la fonction d'éléments enhanceurs à l'aide de la transgénèse chez le poisson zèbre. Nous utilisons cette procédure pour étudier la régulation transcriptionnelle de gènes importants dans le développement squelettique. Commençons donc.

Pour identifier les séquences non codantes entourant les gènes candidats, nous utilisons l'algorithme fast cons, accessible sous forme de piste sur le navigateur génomique uc SC. Nous nous intéressons principalement aux gènes exprimés durant le développement squelettique, mais la même approche peut être utilisée pour étudier n'importe quels gènes exprimés au cours du développement précoce. Dans l'exemple présenté ici, nous avons identifié des séquences conservées.

Dans l'intervalle entourant le gène humain bumper, nous examinons l'intervalle complet jusqu'aux gènes adjacents et déterminons un seuil de score logarithmique spécifique à faible taille correspondant à environ les 5 % supérieurs de la séquence non codante. Après avoir sélectionné les séquences, concevoir des amorces à l'aide de primer three afin d'amplifier chaque séquence à partir de l'ADN génomique humain ; les amorces doivent être choisies pour amplifier la région conservée ainsi que 30 paires de bases ou plus de chaque côté. Amplifier la région d'intérêt à l'aide d'une polymérase de haute qualité en utilisant de l'ADN génomique humain, puis utiliser des procédures standards de biologie moléculaire en laboratoire pour cloner le produit amplifié dans un vecteur d'expression.

Le vecteur utilisé dans ce protocole est PG wc FOS GFPA gateway. Vecteur destination. Après la création du vecteur, procéder à la transposition.

L'enzyme nécessaire à la transposition est d'abord transcrite in vitro à l'aide du kit M message M machine d'Ambion et du plasmide PGB 600 avant les injections expérimentales. Tester l'efficacité de chaque lot de transposases en effectuant une injection avec un amplificateur connu, comme l'amplificateur souris socks. 10 amplificateur.

Pour préparer les injections, tirez les aiguilles utilisées pour la microinjection à partir de verre capillaire à filament de 1,2 millimètre de diamètre externe sur un tireur de micropipettes Sutter P 97. Utilisez un programme permettant d'obtenir une pointe solide avec un affinement précis afin de pénétrer les chorions intacts à l'aide d'un rasoir propre et d'une lame micrométrique. Cassez manuellement les pointes sous un microscope stéréo jusqu'à un diamètre externe d'environ 15 micromètres.

Les aiguilles peuvent être conservées pendant un jour dans un plat de maintien couvert. Maintenir la population de poissons zèbres selon un cycle lumineux régulier clair/obscur de 14 heures de lumière, dans des conditions standard, la veille de la réalisation des micro-injections. Préparer les poissons pour des accouplements synchronisés dans de petits aquariums de reproduction.

Placer trois femelles ou deux mâles par aquarium en rangées parallèles le matin des micro-injections, peu de temps après le début du cycle lumineux. Combiner mâles et femelles dans de l’eau traitée du système propre pour la production d’œufs. Vérifier fréquemment les poissons et recueillir les œufs quelques minutes après leur ponte afin d’obtenir des lots bien synchronisés.

Assurez la production d'œufs pendant deux à trois heures en continuant à combiner de nouveaux groupes de poissons tout au long de la matinée à l’aide d’une pipette en verre de cinq pouces et quart à large orifice équipée d’une poire en latex. Triez les embryons recueillis dans des boîtes de Pétri de 60 par 15 millimètres, partiellement remplies de milieu pour embryons, par groupes de 50 embryons. Indiquez sur le couvercle de chaque boîte l’heure de prélèvement.

Pour chaque ponte d'embryons collectée, conserver une boîte contenant 50 embryons comme témoin non injecté entre les prélèvements d'œufs. Préparer des solutions d'injection fraîches en mélangeant les ingrédients suivants dans un tube microcentrifuge et les conserver sur de la glace. Placer les aiguilles d'injection dans des boîtes de maintien et les remplir avec 1,5 à deux microlitres de solution d'injection.

En pipettant des gouttes de 500 nanolitres sur l'extrémité large de chaque aiguille. Le liquide sera attiré vers la pointe par action capillaire. Préparez au moins deux aiguilles pour chaque solution d'injection.

Insérez l'aiguille remplie dans le porte-aiguille manuel d'une pompe pneumatique pico ou d'un injecteur à pression similaire, configuré et raccordé à une bouteille d'azote conformément aux instructions du fabricant. Étalonnez les volumes d'injection en mesurant le diamètre des gouttelettes expulsées dans de l'huile minérale sur une lame de micromètre, généralement avec un temps d'injection de 120 millisecondes.

Avec une pression de 20 PS, je produirai une goutte d'environ un nanolitre en utilisant un microscope stéréo avec un grossissement de 6 à 10 x. Maintenir l'embryon en place à l'aide d'une pince fine et pousser l'aiguille d'injection avec une pression constante à travers la chorioine jusqu'au vitellus d'un embryon au stade d'une cellule ou au début du stade de deux cellules, positionner la pointe de l'aiguille dans le vitellus juste sous les blastomères, expulser environ un nanolitre de solution d'injection, puis retirer l'aiguille. Pour chaque construction, nous injectons un nombre supérieur ou égal à 200 embryons. Après l'injection, trier les embryons en éliminant les œufs non fécondés, les embryons endommagés, les échecs d'injection ou les embryons ne contenant pas de rouge de phénol dans les blastomères.

Nous incubons ensuite les embryons et le milieu embryonnaire à 28,5 degrés Celsius jusqu'au moment approprié pour les observations. Nous allons maintenant vous montrer quelques résultats représentatifs d'éléments activateurs produisant des patrons spécifiques de tissus d'expression de la GFP dans l'embryon de poisson zèbre. Nous étudions les gènes exprimés dans l'os ou le cartilage pendant.

Voici un exemple d'élément amplificateur en amont du gène acan qui régule l'expression dans le cartilage crânio-facial trois jours après la fécondation. Voici un autre amplificateur, provenant cette fois du gène bumper, qui régule l'expression dans les cellules osseuses. À cinq jours, parmi les nombreux amplificateurs que nous avons identifiés, nous observons peu de corrélation entre la position relative par rapport au gène et la régulation de l'expression.

Lors du choix des séquences à tester, il est important de se rappeler qu'un enhancer peut se situer à des centaines de kilobases en amont ou en aval d'un gène, ou encore dans l'un des introns, comme on le voit dans cet embryon. Une partie importante des séquences ne semble pas réguler l'expression tissu-spécifique. Celles-ci présentent souvent une fluorescence très faible ou quelques cellules dispersées dans deux sites fréquents d'expression ectopique : l'épiderme et le muscle squelettique.

Nous venons de vous montrer comment identifier des éléments enhanceurs potentiels par la conservation de séquence et tester leur fonction grâce à la transgénèse mosaique chez le poisson-zèbre. Lors de cette procédure, il est important d'examiner la qualité de votre ADN et ARN destinés aux injections. Veillez également à examiner attentivement tous vos embryons injectés, en particulier si vous vous attendez à une expression dans un petit groupe de cellules.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.