Partie analyse complète de la composition des parois des cellules végétales (biomasse lignocellulosique) I: La lignine

La détermination de la teneur et de la composition en lignine des parois cellulaires végétales commence par du matériel végétal sec, soumis à diverses extractions. Le matériau obtenu ne contient que des parois cellulaires, puis est fractionné afin de déterminer la teneur en lignine. Le matériau pariétal est soumis à une hydrolyse par le bromure d'acétyle et les monomères solubilisés sont quantifiés par spectrométrie UV pour déterminer la composition de la lignine.

Le matériau pariétal est hydrolysé par cytolyses. Les composants de la lignine solubilisés sont ensuite dérivés en leurs dérivés volatils de triméthylsilane, qui peuvent être séparés et quantifiés par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse. La détermination de la composition en polysaccharides de la matrice et en contenu de cellulose est présentée dans une autre vidéo intitulée Analyse compositionnelle complète des parois cellulaires végétales, deuxième partie : Glucides.

Bonjour, je suis Marcus Pauley, responsable de l'installation analytique Wall au sein du Great Lakes Bioenergy Research Center de la Michigan State University. Je suis Cliff Foster, gestionnaire de l'unité analytique de la paroi cellulaire. Nous allons vous montrer la procédure permettant de déterminer la teneur et la composition des échantillons de biomasse végétale.

Les plantes transforment l'énergie lumineuse du soleil en énergie chimique, comme la biomasse. La biomasse végétale se compose principalement de parois cellulaires, un réseau complexe de divers polymères qui entourent toutes les cellules végétales. Ici, nous déterminons la composition des matériaux de la paroi cellulaire végétale afin d'évaluer le potentiel de transformation de ces lignines et celluloses X, qui constituent une ressource renouvelable très abondante, en biocarburants.

Aujourd'hui, nous nous concentrerons sur le polyphénol lignine dans une autre vidéo intitulée Analyse compositionnelle complète des parois cellulaires végétales, deuxième partie glucides. Nous nous concentrerons sur l'analyse des polysaccharides. Pour commencer cette procédure, ajoutez trois billes d'acier inoxydable de 5,5 millimètres à un tube fileté de 2 millilitres avec bouchon vissé et environ 60 à 70 milligrammes de matériel végétal séché à l'air ou lyophilisé.

Le matériau peut être broyé en une fine poudre à l'aide d'un eyewall, un robot de broyage et de distribution. L'eyewall prend le tube et le secoue pendant 30 secondes, de sorte que, grâce aux billes métalliques, le matériau est réduit en une fine poudre ; ensuite, la poudre végétale broyée mais compacte est desserrée selon une procédure alternative non robotisée à faible débit. La facilitation d'un rétro est présentée dans la deuxième partie : ajoutez 1,5 M d'éthanol aqueux à 70 % au matériau broyé, vortexez soigneusement, puis centrifugez à température ambiante.

Ce traitement solubilise la plupart des protéines et des organites cellulaires ; aspirez le surnageant et ajoutez un volume égal de solution chloroforme-méthanol au culot insoluble dans l'alcool. Agitez soigneusement pour redisperser le culot, puis centrifugez. Le chloroforme-méthanol extrait les composés hydrophobes tels que les lipides ; après centrifugation, aspirez le surnageant et resuspendez le culot dans 500 microlitres d'acétone.

Pour sécher l'échantillon, évaporer le solvant à l'aide d'un courant d'air à 35 degrés Celsius jusqu'à dessiccation complète ; les échantillons séchés peuvent être conservés à température ambiante jusqu'au traitement ultérieur. Pour initier la suppression de l'amidon de l'échantillon reus, suspendre le culot dans 1,5 mL de 0,1 molaire d'acétate de sodium à pH 5, boucher les tubes et les chauffer dans un bloc chauffant afin de gélatiniser l'amidon. Après refroidissement de la suspension sur de la glace, ajouter le mélange d'enzymes dégradant l'amidon, boucher le tube, vortexer soigneusement, puis incuber la suspension toute la nuit.

Dans l'agitateurbain à 37 degrés Celsius, un agitateur rotatif assure un mélange adéquat. Après l'incubation nocturne, arrêter la digestion en chauffant dans un bloc chauffant à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes. Puis centrifuger et éliminer le surnageant, qui contient de l'amidon solubilisé.

Laver le culot restant trois fois en utilisant 1,5 mL d'eau à chaque fois, en vortexant, centrifugeant et décantant comme indiqué précédemment. Enfin, resuspendre le culot dans 500 microlitres d'acétone et évaporer le solvant à l'aide d'un courant d'air à 35 degrés Celsius jusqu'à dessiccation. Les échantillons desséchés contenant la paroi cellulaire isolée ou la jambe, sans celluloses, sont prêts pour des analyses supplémentaires et peuvent être conservés à température ambiante.

Commencez par peser entre un et 1,5 milligramme de matériau de paroi cellulaire préparé. Le pesage peut être effectué manuellement ou de manière automatisée à l’aide de la paroi oculaire, comme illustré dans la deuxième partie. Rincez les parois du tube avec 250 microlitres d’acétone afin de recueillir le matériau de paroi cellulaire au fond du tube, puis évaporez délicatement l’acétone sous un courant d’air.

Une fois que l'acétone s'est évaporée, ajoutez délicatement 100 microlitres de bromure d'acétyle fraîchement préparé à 25 % volume pour volume dans l'acide acétique glacial le long des deux parois. Pour éviter les éclaboussures, un léger bromure dégrade le polymère de lignine en ses monomères acétylés. Ensuite, fermez le flacon jaugé et chauffez à 50 degrés Celsius pendant deux heures.

Chauffer une heure supplémentaire en textant toutes les 15 minutes, puis refroidir sur de la glace. À température ambiante, après refroidissement du ballon, ajouter 400 microlitres de soude à deux molaire et 70 microlitres d'hydroxylamine hydrochlorure fraîchement préparée à 0,5 molaire, puis vortexer les fioles jaugées. Ensuite, neutraliser la solution en complétant exactement jusqu'au trait de jauge de deux millilitres dans la fiole jaugée avec de l'acide acétique glacial, boucher et retourner plusieurs fois pour homogénéiser. Prélever 200 microlitres de la solution contenant les monoaldéhydes hydrolysés et solubilisés à l’aide d’une pipette et les transférer dans une plaque UV spécifique de 96 puits, puis lire la plaque dans un lecteur de plaques à 280 nanomètres. Lire la plaque au moins trois fois et faire la moyenne des absorbances, car les particules peuvent provoquer de légères variations des valeurs d'absorbance.

Déterminez le pourcentage de lignine soluble dans le bromure subtil ou ABS à l’aide du coefficient végétal approprié et de la formule présentée dans le protocole écrit. La lignine est un réseau de polyphénols composé principalement de trois sous-unités : les unités phénoliques P-hydroxy, guaïacyle et sirapyle, permettant de déterminer la composition de la lignine dans le matériau végétal. Commencez par transférer environ deux milligrammes de matériau de paroi cellulaire dans un tube en verre à vis pour cytolyses.

Ensuite, préparez-vous à préparer la solution de 2,5 % de trifluorure de bore éthylate et de 10 % d'éthanethiol dans la dioxane. Étant donné que la dioxane est très dangereuse, n'effectuez aucun prélèvement ni n'emmenez aucun équipement hors de la hotte. N'oubliez pas de travailler avec beaucoup de précaution et d'utiliser un ballon rempli de gaz azote pour compenser le volume perdu dans la bouteille de dioxane en azote.

Préparer la solution en mélangeant les volumes suivants par échantillon : 175 microlitres de dioxane, 20 microlitres d'ETSH et 5 microlitres de BF trois. Après homogénéisation, ajouter 200 microlitres de la solution à chaque échantillon. Purger l'espace libre du flacon avec du gaz azote et boucher.

Procédez immédiatement au chauffage des échantillons à 100 degrés Celsius pendant quatre heures, avec un mélange doux toutes les heures. Terminez la réaction de lyse en plaçant sur de la glace pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite 150 microlitres de bicarbonate de sodium 0,4 molaire pour neutraliser, puis vortexez.

Pour la purification des produits de dégradation de la lignine, ajouter un millilitre d'eau et 0,5 millilitre d'acétate, vortexer et laisser séparer les phases. La couche d'acétate d'éthyle se situera en haut et l'eau en bas. Transférer 150 microlitres de la couche supérieure d'acétate d'éthyle contenant les composants de la lignine dans un tube de deux millilitres, en veillant à ne pas transférer d'eau.

Après le transfert à partir de la couche supérieure d'acétate d'éthyle, évaporer le solvant à l'aide d'un concentrateur avec de l'air. Ajouter 200 microlitres d'acétone et évaporer. Répéter le traitement avec l'acétone deux fois pour éliminer l'excès d'eau.

Ensuite, dériver les composants de la lignine en leurs dérivés volatils de triméthylsilyl. Ajouter 500 microlitres d'acétate d'éthyle, 20 microlitres de purine et 100 microlitres de N,O-bis(triméthylsilyl)acétamide dans chaque tube. Incuber pendant deux heures à 25 degrés Celsius.

À la fin des deux heures, transférez 100 microlitres de la réaction dans un flacon de chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS) et ajoutez 100 microlitres d'acétone. Analysez les échantillons par chromatographie en phase gazeuse équipée d'un spectromètre de masse quadrupôle ou d'un détecteur à ionisation de flamme. Pour les informations concernant la colonne et les détails de l'analyse, veuillez consulter le protocole écrit accompagnant.

Voici quelques résultats représentatifs de l'analyse de la lignine utilisant le bois de peuplier comme matériau végétal. Selon cette analyse, 22 % du matériau de peuplier est constitué de la lignine, un polyphénol. La composition des composants de la lignine a été analysée par GCMS.

Les pics sont identifiés par leurs temps de rétention relatifs à l'aide d'un étalon interne de tétracône ou par les icônes caractéristiques du spectre de masse à 299 m/z, 269 m/z et 239 m/z respectivement pour les monomères S et G. La composition des composants de la lignine est quantifiée en fixant la surface totale des pics à 100 %. L'analyse de composition montre que cet échantillon particulier contient principalement des unités de type S, ou unités S. Toutefois, les unités Goya, aol ou G sont également abondantes.

Évidemment, la quantité et la composition en unités monomériques peuvent varier selon le tissu végétal et l'espèce. Nous venons de vous montrer comment déterminer la teneur et la composition en lignine du matériel végétal pour l'analyse des polysaccharides. Passez à la deuxième partie.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.