Analyse de la composition globale de la paroi cellulaire végétale (biomasse lignocellulosique) Partie II: Glucides

La détermination de la composition en polysaccharides de la matrice et de la teneur en cellulose cristalline des parois cellulaires végétales débute avec un matériau végétal sec, soumis à diverses extractions. Le matériau obtenu ne contient que des parois cellulaires, puis est fractionné afin de déterminer la composition en polysaccharides de la matrice. Le matériau de paroi est traité avec un acide faible pour hydrolyser les polysaccharides non cristallins, principalement les hémicelluloses, en leurs monosaccharides respectifs.

Les monosaccharides sont ensuite dérivés en leurs aldol acétates volatils correspondants, qui sont ensuite analysés et quantifiés par chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse pour la détermination de la cellulose cristalline. Les parois cellulaires sont traitées avec le réactif GRAph, un mélange d'acides qui élimine les composants pariétaux non cristallins. La cellulose cristalline restante est dégradée en son monomère glucose, qui peut être dosé par méthode colorimétrique.

La détermination de la teneur et de la composition en lignine est présentée dans une autre publication vidéo de JoVE intitulée Analyse complète de la composition des parois cellulaires végétales, première partie : la lignine. Bonjour, je suis Marcus Pauley, responsable de l'unité d'analyse des parois à l'Institut de recherche sur la bioénergie des Grands Lacs de l'Université d'État du Michigan. Je suis Cliff Foster, gestionnaire de l'unité d'analyse des parois cellulaires.

Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment déterminer la composition des polysaccharides présents dans la matière de la paroi cellulaire végétale, à savoir la cellulose, dans diverses homocelluloses. Ici, au Great Lakes Bioenergy Research Center, nous développons des technologies permettant de convertir ces sucres en biocarburants. Afin d'identifier une matière première végétale optimale, nous devons d'abord évaluer la nature et l'abondance des sucres présents dans cette biomasse.

Dans une autre vidéo intitulée Analyse complète de la composition des parois cellulaires végétales, première partie Lignine, nous nous concentrerons sur l'analyse des polyphénols. Commençons donc. Commencez cette procédure par l'isolement des parois cellulaires.

Broyez environ 60 à 70 milligrammes de matériel végétal sec avec des billes d'acier inoxydable de 5,5 millimètres dans un tube à vis SAR TED de deux millilitres. En utilisant un broyeur REM comme alternative à haut débit, employez un robot de broyage et de distribution appelé eyewall, tel que décrit dans la première partie. Une fois le broyage terminé, retirez les billes d'acier.

Continuer à isoler les parois cellulaires et à éliminer l'amidon résiduel comme indiqué dans la première partie et décrit dans le protocole écrit accompagnant. Peser deux milligrammes de matériau de paroi cellulaire d'amidon DS dans un tube de deux mill. Une méthode à haut débit pour effectuer cette tâche est le robot eyewall.

Le robot prend un tube contenant du matériel végétal broyé et perce un trou dans le fond du tube. Le tube percé est ensuite placé sur un alimentateur VI. Un tube vide est placé sur une balance et déplacé sous l'alimentateur VI ; par vibration, le matériau percole à travers le trou du tube supérieur chargé dans le tube inférieur vide jusqu'à ce que la quantité souhaitée de matériau soit accumulée.

Ajouter 100 microgrammes d'acétol comme étalon interne. Rincer les parois du tube avec de l'acétone afin de recueillir le matériel pariétal au fond du tube, puis évaporer délicatement l'acétone sous flux d'air. Ensuite, effectuer une hydrolyse par acide faible.

Ajouter soigneusement 250 microlitres d'acide trichloroacétique à deux molarités, ou TFA, à chaque échantillon, en veillant à ce qu'aucun matériau ne soit projeté sur les parois des tubes. Boucher étroitement les tubes et les incuber à 121 degrés Celsius dans un bloc chauffant pendant 90 minutes. Ensuite, refroidir les blocs chauffants et les échantillons sur de la glace et centrifuger les tubes à 10 000 tr/min pendant 10 minutes.

Transférez 100 microlitres du surnageant acide contenant les sucres solubilisés du polysaccharide matriciel dans des vials à vis, en veillant à ne pas perturber le culot. Le culot peut être utilisé pour le dosage de la cellulose cristalline. Évaporez le TFA dans un tube en verre sous un flux doux d'air à l’aide d’un appareil d’évaporation.

Ajoutez 300 microlitres de deux propanol pour éliminer l'excès d'acide, vortexez et évaporez à 25 degrés Celsius. Répétez au total trois fois. Afin de permettre l'identification des monosaccharides par chromatographie en phase gazeuse, effectuez une dérivation en aldol acétate.

Tout d'abord, réduire les monosaccharides en leurs aldols ouverts correspondants, puis acétyler ces derniers. Se référer au protocole écrit joint pour des instructions détaillées. Chaque étape de la procédure suit le protocole précédemment décrit : ajout du réactif, incubation, évaporation sous un courant d'air, puis élimination de l'excès de réactif par diverses étapes de lavage.

Dans les étapes finales, les acétates d'aldol sont extraits. Ajoutez d'abord 500 microlitres d'acétate d'éthyle et agitez doucement. Ajoutez ensuite deux millilitres d'eau, fermez les tubes et vortexez. Centrifugez les tubes à 2000 tr/min pendant cinq minutes afin d'obtenir des couches distinctes et claires, l'acétate d'éthyle se trouvant en haut contenant les acétates d'Al Dettol et l'eau en bas. Pipetez 50 microlitres de la couche d'acétate d'éthyle dans des vials pour GCMS munis d'inserts. Diluez en ajoutant 100 microlitres d'acétone au vial de chromatographie en phase gazeuse. Le vial de chromatographie en phase gazeuse peut être conservé à quatre degrés Celsius.

Si l'analyse par GC-MS ne peut pas être effectuée immédiatement, injectez les échantillons dans un chromatographe en phase gazeuse équipé d'un spectromètre de masse quadrupôle. Pour la colonne et les détails de l'analyse, veuillez consulter le protocole écrit joint. La matière première permettant de déterminer la teneur en cellulose cristalline peut être un matériau pariétal isolé ou un matériau pariétal déjà traité par l'acide faible TFA, soit immédiatement après le traitement acide, soit sous forme sèche stockable.

Après avoir éliminé l'excès d'acide trifluoroacétique (TFA) à l'aide d'isopropanol comme indiqué précédemment, ajouter au culot de TFA dans les deux tubes M un volume de réactif Updegra composé d'acide acétique, d'acide nitrique et d'eau, dans un rapport volumétrique de huit à un à deux. Fermer hermétiquement le tube, vortexer et chauffer sur un bloc chauffant à 100 °C pendant 30 minutes. À la suite de ce traitement, seul le cellulose cristallin subsiste dans le culot.

Tous les autres polysaccharides sont hydrolysés dans des échantillons refroidis, en passant du bloc de glace à la température ambiante ou à une température plus basse. Ensuite, centrifuger les échantillons à 10 000 tr/min pendant 15 minutes ; après la centrifugation, éliminer le surnageant en veillant à ne pas perturber le culot et à ne retirer aucun matériau du culot. À cet effet, laisser environ 150 microlitres de surnageant dans le tube, puis laver le culot plusieurs fois avec de l'eau.

Ensuite, effectuez une hydrolyse avec de l'acide sulfurique concentré afin d'hydrolyser complètement le cristal et le culot de cellulose en glucose. Commencez par ajouter 175 microlitres d'acide sulfurique à 72 % dans le tube sarta et incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Après l'incubation initiale, vortexez l'échantillon et incubez-le pendant 15 minutes supplémentaires.

Ensuite, ajouter 825 microlitres d'eau, vortexer et centrifuger les échantillons à 10 000 tr/min pendant cinq minutes. Il peut rester dans le tube un matériau brun et soluble, principalement de la lignine, tandis que le glucose se trouve dans le surnageant. La teneur en glucose du surnageant est dosée à l'aide du dosage colorimétrique à l'anthrone.

Cet essai est réalisé dans une plaque microtitration en polystyrène de 96 puits. Établissez une courbe standard de glucose en double en suivant les instructions du protocole écrit joint. Préparez les échantillons en combinant 10 microlitres de chaque échantillon, surnageant, et 90 microlitres d'eau dans des puits distincts de la même plaque microtitration que la courbe standard, puis terminez en ajoutant 200 microlitres de réactif fraîchement préparé et homogénéisé.

Ensuite, chauffer la plaque pendant 30 minutes à 80 degrés Celsius dans un four muni d'un répartiteur de chaleur en aluminium. Observer que les échantillons contenant du glucose passent du jaune au vert-bleu lorsque le chauffage est terminé. Laisser refroidir la plaque à température ambiante et agiter soigneusement.

Lire l'absorption à 625 nanomètres à l'aide d'un lecteur de microplaques. La teneur en glucose, l'unité structurale de la cellulose, est calculée à partir de l'absorbance comparée à la courbe standard établie sur la même plaque. Voici quelques résultats représentatifs de l'analyse des polysaccharides d'un échantillon de bois de peuplier.

Les pics du chromatogramme en phase gazeuse sont identifiés par les profils de masse et/ou les temps de rétention des étalons. Les monosaccharides sont quantifiés à partir de courbes standards. L'analyse sucrière des polysaccharides de la matrice révèle une forte abondance de xylose, représentant l'hémicellulose xylan, mais d'autres sucres sont également présents.

Selon l'analyse, 40 % du matériau de peuplier est constitué de cellulose cristalline. Veuillez noter que ces teneurs et compositions peuvent varier d'une plante à l'autre ou entre différentes anatomies végétales. Nous venons de vous montrer comment déterminer la teneur en polysaccharides et réaliser l'analyse compositionnelle de la biomasse lignocellulosique pour l'analyse de la lignine polyphénolique.

Abonnez-vous à la première partie. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.