Décrypter Pathways axonale des groupes génétiquement définis de neurones dans le tube neural Chick Utilisant In ovo L'électroporation
2 mai 2010
Cette vidéo montre comment visualiser les voies axonales des groupes génétiquement définis des neurones de la moelle épinière embryonnaire de poulet en utilisant In ovo de gènes rapporteurs sous le contrôle des éléments activateurs spécifiques.
Bonjour, je suis Ham du laboratoire du Dr. Review Klar au département de neurobiologie médicale de l'Université hébraïque de Jérusalem. Bonjour, je suis Sophie Esman et je viens également du laboratoire de Lars. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure pour l'électroporation in vivo et la préparation en livre ouvert de la moelle épinière.
Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les trajectoires axonales de populations neuronales définies génétiquement dans la moelle épinière embryonnaire. Commençons donc. Pour commencer cette procédure, transférez des œufs de poule Leghorn blancs fécondés, conservés à température ambiante, vers un incubateur humidifié, de préférence équipé de plateaux oscillants, à une température de 37 à 38 degrés Celsius.
Il est important de surveiller la température et l'humidité de l'incubateur afin d'obtenir des embryons viables et synchronisés. Les embryons de poulet sont électroporés lorsqu'ils ont atteint le stade de Hamburger et Hamilton ou stade HH 18 à 20, qui constitue une étape optimale pour l'expression spécifique dépendante des enhanceurs. À ce stade, la tête est disposée perpendiculairement au tronc.
Également au stade HH 18 à 20, un vaste ensemble de vaisseaux sanguins extra-embryonnaires, tels que les vaisseaux des lignes vitellines antérieure, postérieure, droite et gauche, doit également être visible. Les embryons de poulet atteignent le stade HH 19 à 20 après 66 heures d'incubation, et à ce moment, retirez les œufs de l'incubateur. Après avoir retiré les œufs, placez-les horizontalement et attendez cinq à dix minutes. L'embryon se trouve désormais au pôle supérieur de l'œuf.
Avant l'électroporation, préparer les embryons dans une solution de Hank contenant 100 unités par millilitre de pénicilline et 0,1 milligramme par millilitre de streptomycine. Préparer un mélange d'ADN à une concentration de deux à cinq microgrammes par microlitre et ajouter quelques cristaux de colorant vert rapide pour faciliter la visualisation de l'ADN injecté. Avoir à portée de main une pipette à bouche, une aiguille stérile pour seringue, de petites ciseaux et un ruban adhésif.
Préparez des microcapillaires en tirant des capillaires en verre de 0,5 millimètre de diamètre à l’aide d’un tireur de pipettes. Placez les électrodes en tungstène dans les micromanipulateurs et reliez les électrodes au générateur d’impulsions. Réglez la tension du générateur d’impulsions à moins 30 volts, la durée de chaque impulsion à 50 millisecondes et le nombre d’impulsions à trois.
Passez à l'électroporation avant d'exposer et de manipuler les embryons. Insérez une seringue au pôle étroit de l'œuf et retirez cinq à six millilitres d'albumine de chaque œuf. L'albumine est retirée afin d'éviter qu'elle ne se répande.
Lors de la coupe à l'étape suivante, utilisez de petites ciseaux pour couper. Ouvrez une fenêtre ovale sur le côté supérieur de l'œuf après avoir mis à nu l'embryon de poulet, puis humidifiez-le avec 0,5 à un millilitre de solution de Hanks contenant de la pénicilline et du streptomycine. Ensuite, utilisez un pipeteur buccal pour charger la microcapillaire en verre.
Avec un mélange de colorant d'ADN, une microcapillaire de diamètre approprié doit se charger facilement en ADN. Sous un microscope stéréo, positionnez l'embryon pour injecter l'ADN dans le tube neural. Placez l'embryon avec sa queue tournée vers vous.
À ce stade du développement, la moelle épinière est clairement visible et aucune technique de contraste n'est donc nécessaire. La moelle épinière est fermée aux deux extrémités, céphalique et caudale. Toutefois, en effectuant des ponctions avec une microcapillaire pour créer une ouverture supplémentaire dans le tube neural et en pénétrant celui-ci selon un angle peu prononcé, une microcapillaire suffisamment fine et de diamètre approprié devrait traverser le tube sans l'endommager.
Injectez l'ADN à l'aide d'un pipeteur buccal. Une microcapillaire de diamètre approprié doit libérer l'ADN lors d'une expiration régulière. Le colorant vert doit s'étendre depuis l'extrémité de la queue jusqu'aux vésicules du cerveau en développement.
Injecter jusqu'à ce que le tube neural soit rempli d'ADN. L'électroporation est nécessaire pour que l'ADN injecté pénètre dans les cellules. Premièrement, placer les électrodes parallèlement au tube neural et aussi près que possible de celui-ci sans le toucher directement. S'assurer que les électrodes sont recouvertes de liquide afin d'assurer la conductivité électrique pendant l'impulsion.
En général, la solution de Hank ajoutée immédiatement après l'exposition de l'embryon est suffisante. Mais sinon, ajoutez une goutte de solution de Hank juste avant l'impulsion, avec les électrodes positionnées et immergées dans le liquide, puis appliquez l'impulsion électrique. Retirez ensuite soigneusement les électrodes et scellez la fenêtre ainsi que l'œuf avec du ruban adhésif. Il est important de bien sceller l'œuf entièrement afin d'éviter le dessèchement de l'embryon pendant la période d'incubation suivante.
Remettez l'œuf dans l'incubateur et poursuivez l'incubation jusqu'à ce que l'embryon de poussin atteigne le stade embryonnaire de développement. Jour six ou E6, moment venu pour l'imagerie, lorsque l'embryon électroporé a atteint le stade embryonnaire de développement. Jour six, E6, trois jours après l'électroporation, retirez-le de l'œuf et placez-le dans une boîte de Pétri revêtue de silicone contenant du PBS à l'aide de ciseaux fins.
Retirez les membranes et étirez l'embryon sur son côté ventral à l'aide d'épingles enfoncées dans le silicone pour le maintenir en place. À l’aide d’une microcapillaire en tungstène effilée, pratiquez une incision longitudinale le long de la plaque du toit, depuis le cerveau postérieur jusqu’à la queue.
Effectuez deux incisions longitudinales supplémentaires de chaque côté de la moelle épinière, en détachant les ganglions de la racine dorsale ou DRG de la moelle épinière. Détachez la lame du plancher de la moelle à partir de la queue jusqu'au cerveau postérieur, en laissant la moelle épinière intacte. Enfin, utilisez des ciseaux fins pour couper la moelle épinière en section transversale au niveau du cerveau postérieur et séparez-la du corps.
À présent que la moelle épinière a été isolée, étalez-la dans une nouvelle boîte de Pétri revêtue de silicone contenant du PBS en utilisant des épingles pour la maintenir depuis le cerveau postérieur jusqu'à la queue, afin d'obtenir une préparation en montage plat. Fixez la moelle épinière dans du paraformaldéhyde 4 % dans du PBS pendant une heure à température ambiante, puis procédez au marquage immunohistochimique selon la procédure d'immunohistochimie décrite dans le protocole écrit accompagnant la mise en place de la moelle épinière ouverte. Préparez-la en forme de livre pour l'imagerie.
Étaler de la graisse ou du silicone en forme de rectangle sur une lame et déposer du PBS en gouttes à l'intérieur du rectangle. Utiliser une pince pour placer la moelle épinière, en la tendant au milieu du rectangle, puis absorber le liquide autour. À l’aide d’un applicateur en plastique, déposer une à deux gouttes de milieu de montage sur la moelle épinière et recouvrir d’une lamelle.
Appliquez une pression sur la lame couvre-objet afin d'éviter les bulles d'air. Conservez les lames à l'obscurité à quatre degrés Celsius.
Examinez la moelle épinière à l'aide d'une microscopie confocale. Voici quelques résultats représentatifs de rejets axonaux d'interneurones spinaux de poulet dans des expériences témoins où la RFP est exprimée dans tous les neurones à l'aide d'un élément amplificateur ubiquitaire du CMV : la majorité des neurones et de leurs axones sont marqués. Il est impossible de déchiffrer la trajectoire axonale des sous-populations neuronales.
Cependant, lorsqu'on applique des éléments enhanceurs spécifiques, un trajet axonal défini d'une sous-population spécifique de neurones DI deux est révélé dans cet exemple. Nous venons donc de vous montrer comment électroporer un tube neural de mâchoire avec un enhanceur neuronal spécifique au stade E trois et comment préparer une moelle épinière en livre ouvert au stade E six. Lorsque vous effectuez cette procédure, vous devez vous souvenir de faire preuve de prudence et de patience.
Voilà donc tout ce qu'il y a à savoir. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences. Bonne chance.
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Aperçu
Ce vidéo montre une procédure permettant de visualiser les trajets axonaux de neurones génétiquement définis dans la moelle épinière de poulet embryonnaire à l'aide de l'électroporation in ovo. La méthode permet aux chercheurs d'étudier efficacement les trajectoires axonales.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie du développement
- Électrophysiologie
Contexte
- Comprendre les voies axonales est essentiel pour la recherche en neurosciences.
- L'électroporation in ovo est une technique utilisée pour introduire des gènes rapporteurs.
- La moelle épinière du poulet embryonnaire sert de modèle pour l'étude du développement neuronal.
- Des populations neuronales définies génétiquement peuvent fournir des informations sur des circuits neuronaux spécifiques.
Objectif de l'étude
- Visualiser les voies axonales dans la moelle épinière embryonnaire.
- Utiliser l'électroporation in ovo pour des études d'expression génique.
- Approfondir la compréhension du développement neuronal et des connexions neuronales.
Méthodes utilisées
- Transférer les œufs de poulet fécondés dans un incubateur humidifié.
- Maintenir l’incubation à une température de 37 à 38 degrés Celsius.
- Réaliser une électroporation in ovo pour introduire des gènes rapporteurs.
- Préparer des échantillons de « livre ouvert » de la moelle épinière pour la visualisation.
Résultats principaux
- Visualisation réussie des voies axonales dans la moelle épinière.
- Démonstration de l'efficacité de l'électroporation in ovo.
- Apercus sur les trajectoires de populations neuronales définies génétiquement.
- Mise en place d'une méthode fiable pour l'étude du développement neuronal.
Conclusions
- La méthode fournit un outil précieux pour la recherche en neurosciences.
- L'électroporation in ovo est efficace pour la livraison de gènes dans les modèles embryonnaires.
- La compréhension des voies axonales peut éclairer les études sur la formation des circuits neuronaux.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans l'industrie
Cette méthode permet une visualisation précise des trajectoires axonales au sein de populations neuronales définies génétiquement, répondant ainsi à un défi majeur dans la validation ciblée, où un marquage bilatéral rend difficile la distinction entre projections homolatérales et contralatérales. En limitant l'expression du marqueur à un seul côté du tube neural par électroporation unilatérale in ovo, les chercheurs parviennent à réduire les risques mécanistiques liés aux hypothèses sur les circuits neuronaux dès les premières étapes de la découverte. Cette approche renforce la confiance prédictive dans le choix des cibles en précisant les schémas de connectivité spécifiques aux voies pertinentes pour les modèles de maladies neurodéveloppementales.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en isolant les projections axonales de sous-populations neuronales spécifiques définies par des rapporteurs dirigés par des activateurs transcriptionnels.
- Valeur opérationnelle : Fournit un marquage unilatéral permettant de distinguer les axones projetant en ipsi- et en contra-latéral, réduisant ainsi l'ambiguïté dans la cartographie des circuits.
- Valeur prédictive : Contribue à l'atténuation du risque biologique des cibles en précisant si une population neuronale active des voies excitatrices ou inhibitrices essentielles au mécanisme de la maladie.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des données quantifiables sur la trajectoire axonale en tant que critère phénotypique pour l'analyse de modulateurs génétiques ou pharmacologiques de l'orientation neuronale.
- Valeur opérationnelle : Produit des préparations standardisées et reproductibles en montage entier, compatibles avec l'imagerie confocale haute résolution et les pipelines d'analyse automatisée.
- Valeur en termes d'évolutivité : Exploite le modèle d'embryon de poulet, facilement adaptable à l'échelle pour des tests multiparamétriques de l'activité d'activateurs ou de l'efficacité de l'électroporation.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur translationnelle : Cartographie les voies axonales pertinentes pour la maladie dans des modèles de moelle épinière vertébrée, permettant une corrélation avec les biomarqueurs humains des troubles du développement neurologique.
- Continuité mécanistique : Établit un lien entre la validation préliminaire des cibles thérapeutiques et l'évaluation préclinique des effets médicamenteux sur la croissance ou le guidage axonal au niveau des circuits neuronaux.
- Progression ajustée au risque : Éclaire les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin en révélant si une cible modifie des schémas de projection spécifiques associés à la récupération fonctionnelle ou à la pathologie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte, de la génération d'hypothèses sur la cible jusqu'à l'identification de composés précurseurs, en fournissant des éclairages mécanistiques qui précèdent le développement des tests fonctionnels et soutiennent l'alignement des biomarqueurs translationnels.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses sur l'expression génique spécifique aux enhanceurs pour définir les sous-populations neuronales et leurs trajectoires axonales.
- Écrans : Permet de disposer de systèmes biologiques prêts à l'emploi, avec une expression normalisée et unilatérale de marqueurs rapporteurs, afin d'évaluer les effets de composés sur le guidage axonal.
- Analytique : Fournit des données quantitatives spatiales sur les schémas de projection axonale, facilitant la comparaison entre différentes conditions génétiques ou traitements.
- Recherche translationnelle : S'intègre aux travaux précliniques en établissant des modèles de voies axonales pertinentes pour les maladies, permettant la corrélation avec des biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour tester de façon itérative des constructions génétiques, des éléments enhanceurs ou des paramètres d'électroporation sur plusieurs cibles neuronales.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en précisant la directionnalité des projections axonales, un facteur déterminant pour évaluer les effets spécifiques des médicaments sur un circuit neuronal donné.
- Valeur opérationnelle : Renforce la reproductibilité et la standardisation grâce à des paramètres d'électroporation définis (tension, durée des impulsions, nombre) et à une manipulation étagée des embryons.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en permettant l'élimination précoce des cibles dont les voies axonales ne correspondent pas aux mécanismes thérapeutiques souhaités.
- Impact sur le portefeuille : Favorise une priorisation ajustée au risque en identifiant les cibles qui modulent des schémas de projection spécifiques liés aux critères cliniques dans les indications liées au développement neurologique.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en techniques embryologiques, notamment le stade des embryons, la microinjection et l'optimisation des paramètres d'électroporation.
- Dépend d'instruments tels que des générateurs d'impulsions, des micromanipulateurs, des électrodes en tungstène et une microscopie confocale pour l'imagerie.
- Exige une standardisation de la concentration d'ADN, du choix des éléments enhanceurs et du positionnement des électrodes entre les utilisateurs et les laboratoires afin d'obtenir des résultats reproductibles.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors du transfert du modèle à d'autres systèmes vertébrés ou à d'autres types de neurones que les interneurones médullaires.
- Les limitations pratiques incluent la sensibilité de la viabilité embryonnaire aux conditions d'incubation et la difficulté technique d'obtenir une électroporation unilatérale uniforme sans endommager le tube neural.
