Livraison efficace de gènes dans les Territoires du SNC multiples à l'aide In Utero L'électroporation

L'objectif général de cette procédure est de modifier l'expression génique dans le système nerveux central embryonnaire des neurones. Cela est réalisé en obtenant d'abord des femelles gestantes à journées contrôlées et en les préparant pour une intervention chirurgicale. Les cornes utérines sont ensuite exposées en pratiquant une incision abdominale.

Une fois les embryons exposés, de l'ADN est injecté dans le ventricule latéral, le troisième ventricule ou l'espace sous-rétinien. La dernière étape de la procédure consiste à appliquer un courant électrique à l'embryon à travers la paroi utérine, en orientant les électrodes plates de manière à ce que le pôle positif soit placé au-dessus du site de transfection souhaité. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la prolifération, la migration et la différenciation des progéniteurs neuronaux dans le cerveau en développement et la rétine par microscopie d'immunofluorescence.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la dégénérescence chez les souris transgéniques, réside dans sa rapidité, sa capacité à permettre des études à haut débit et son coût réduit. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement neuronal, telles que quels gènes régulent les progéniteurs neuronaux, la prolifération cellulaire, la spécification du destin cellulaire, la différenciation neuronale et la migration cellulaire. Les implications de cette technique pourraient s'étendre à une meilleure compréhension des voies génétiques sous-jacentes aux anomalies du développement du système nerveux central, dont beaucoup entraînent des troubles cognitifs et des troubles du comportement chez l'humain, au-delà de son utilité pour l'étude du développement du système nerveux central.

Cette technique peut également être appliquée à d'autres systèmes organiques, comme le système nerveux périphérique en développement, le cœur et le placenta. Elle peut aussi être utilisée pour étudier des modèles de maladies chez la souris ainsi que chez d'autres organismes modèles tels que le poulet et le xip. En général, l'obstacle principal au succès pour les personnes novices dans cette technique est la survie des embryons ; une attention particulière doit être portée lors de la manipulation, de l'injection et du transfert des embryons.

Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque nous avons eu besoin d'un moyen rapide de manipuler l'expression génique dans l'embryon, le télencéphale et la rétine. Nous avons mis au point cette technique dans notre laboratoire en modifiant la méthode initialement décrite par Sal, publiée dans la revue Developmental Biology en 2001. Nous avons également collaboré avec un laboratoire spécialisé pour établir ce protocole dans le dilon en développement.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes d'injection et d'électroporation sont difficiles à apprendre, nécessitant une manipulation très précise des embryons, et les sites d'injection peuvent parfois être très petits. Par exemple, l'espace sous-rétinien. La procédure sera aujourd'hui démontrée par Rajiv, un postdoctorant du laboratoire de Sherman. Commencez par nettoyer et stériliser tous les instruments chirurgicaux. Ensuite, remplissez des seringues avec une solution saline et une solution de Ringer lactatée, puis placez-les sur un coussin chauffant afin de les réchauffer dans la zone chirurgicale.

Stérilisez un coussin chauffant avec de l'éthanol à 70 %, puis recouvrez-le d'un tampon de gaze stérile sans peluches. Réglez le coussin chauffant à 37 degrés Celsius. Placez l'animal dans une petite chambre anesthésique et anesthésiez-le en administrant 5 % d'isoflurane avec de l'oxygène à un litre par minute à l'aide d'un vaporisateur.

S'assurer de recueillir les vapeurs d'isoflurane à l'aide d'un système de captage. Une fois que la respiration de l'animal est profonde et régulière, retirez-le de la chambre. Utilisez la pression sur l'orteil et le réflexe palpébral.

Pour garantir une anesthésie complète, placez l'animal anesthésié sur le ventre et utilisez un tube de respirateur pour délivrer 2,25 %ice de fluor pendant la chirurgie. Injectez de la buprénorphine à une concentration de 0,1 milligramme par kilogramme de poids corporel par voie sous-cutanée à la nuque.

Continuer à surveiller la respiration de l'animal et ajuster le débit d'isoflurane si nécessaire. Ensuite, fixer un ruban adhésif sur la poitrine de l'animal anesthésié et vérifier à nouveau la réponse de rétraction en pinçant la patte postérieure avec une pince effilée. À l’aide d’un coton-tige stérile, appliquer une couche épaisse de crème de sur l’abdomen en veillant à ce que le sous-poil soit entièrement recouvert.

Laissez la crème en place pendant environ trois minutes et vérifiez de manière intermittente le retrait des poils. À l'aide d'un applicateur stérile, humidifiez un tampon de gaze stérile avec de l'eau stérile et essuyez les poils de l'abdomen. Ensuite, stérilisez le site d'incision avec de la chlorhexidine et davantage d'eau.

Séchez l'abdomen avec un tampon de gaze stérile propre. Répétez cette étape avec de l'éthanol à 70 % en utilisant un tampon de gaze de coton stérilisé frais. Préparez-vous à la chirurgie en revêtant une tenue chirurgicale afin d'exposer les cornes utérines.

Tout d'abord, repérez la ligne alba comme la ligne pâle située sous la peau au niveau de la ligne médiane. À l’aide de pinces, tirez la peau loin de la paroi abdominale et pratiquez une petite incision droite partant du milieu de l’abdomen vers le bas, à l’aide de ciseaux à peau en utilisant des pinces et des ciseaux courbes. Répétez le processus avec le péritoine. Saisissez le péritoine avec les pinces.

Éloigner puis pratiquer une incision juste assez grande pour extraire l'utérus. Placer une compresse stérile munie d'une petite fente verticale au-dessus de l'incision et l'humidifier avec du sérum physiologique stérile tiède. Ensuite, glisser la pince dans l'incision et localiser l'utérus en maintenant l'incision ouverte à l'aide de la pince.

Saisir l’utérus entre le premier et le deuxième embryon visibles et tirer doucement les deux cornes utérines sur la gaze. Compter le nombre d’embryons en notant toute résorption ou tout embryon de petite taille. Afin de préparer le nombre correct d’injections d’ADN, humidifier les cornes utérines avec du sérum physiologique et replacer soigneusement une des cornes utérines dans l’abdomen.

Pour charger les aiguilles chirurgicales, utilisez une pipette à piston munie d’un embout buccal afin d’aspirer 10 microlitres d’une solution d’ADN sans endotoxine à trois milligrammes par millilitre contenant du vert de méthyle, puis expulsez l’ADN dans une aiguille chirurgicale. Fixez la première aiguille remplie sur le micromanipulateur.

Commencez par l'embryon le plus proche de l'ovaire en vous appuyant sur l'injecteur. Utilisez des pinces circulaires pour tourner délicatement l'embryon à l'intérieur de la décidua afin de le positionner face vers l'avant, ce qui permet d'effectuer les injections selon un axe allant du ROS vers le cordon. Utilisez une source lumineuse à fibre optique pour identifier la ligne médiane du cerveau embryonnaire.

Observer les grands ventricules latéraux flanqués dans les régions rostrales. Maintenir l'embryon en place à l'aide de forceps courbes et positionner l'aiguille chirurgicale remplie au-dessus de l'utérus de manière à ce que l'angle d'entrée dans le cerveau soit d'environ 45 degrés. D'un mouvement rapide et régulier, tourner le bouton du micromanipulateur pour insérer la pointe de l'aiguille à travers la paroi utérine et dans le ventricule latéral du cerveau embryonnaire.

Ensuite, appuyez sur la pédale du micro-injecteur. Pour injecter la solution d'ADN, une injection réussie est facilement visible par la diffusion du colorant vert de méthyle dans les ventricules cérébraux de l'embryon. Maintenant que l'ADN a été injecté, retirez lentement l'aiguille en la remontant pour l'extraire sans provoquer de rupture.

Placer l'embryon injecté sur la compresse stérile et l'humidifier abondamment avec du sérum physiologique tiède. Saisir l'utérus avec le pôle positif de l'électrode en forme de palette placé au site désiré de transfection. Ensuite, appliquer cinq impulsions électriques carrées de 40 à 50 volts et de 50 millisecondes chacune, à raison d'une impulsion par seconde.

Couvrir l'embryon injecté et électroporé avec un tampon humide protecteur, puis passer à l'injection de l'embryon suivant. Une fois terminée l'injection et l'électroporation de tous les embryons souhaités dans la corne utérine, repousser celle-ci avec précaution dans la cavité corporelle. Retirer la seconde corne utérine pour commencer l'injection et l'électroporation des embryons restants.

Une fois que tous les embryons sont revenus dans l'utérus, ajoutez deux à trois millilitres de sérum physiologique tiède dans la cavité abdominale, puis retirez la gaze de l'abdomen pour découvrir les bords du péritoine. Utilisez du fil de soie noir tressé pour suturer le péritoine en fixant le fil au niveau du péritoine le plus proche du sternum, puis en poursuivant la suture en vous éloignant de l'ancrage. Veillez à ce que toutes les sutures soient bien serrées et à ce que ni les organes sous-jacents ni la peau ne soient pris dans le péritoine.

Couper le reste de la ligne de suture et jeter. Fermer la peau au-dessus de la ligne de suture à l’aide de pinces et de agrafes de fermeture cutanée. Pincer la peau en prenant soin de ne pas agrafer la ligne de suture située en dessous ni de tendre trop fortement la peau.

Une fois terminé, assurez-vous que les agrafes sont bien serrées en appuyant doucement avec l'outil de suture ici, A-P-C-I-G. Deux vecteurs d'expression conduisant l'expression de la GFP ont été électroporés dans le néocortex en développement à E12. Au fur et à mesure du développement du néocortex, les progéniteurs apicaux se différencient soit en progéniteurs basaux secondaires, soit en neurones post-mitotiques, et continuent d'exprimer la GFP. Ces cellules nerveuses peuvent ensuite être analysées pour l'expression de marqueurs typiques du sous-type neuronal illustré en rouge.

Dans cette vue ventrale d'un cerveau antérieur d'embryon électroporé à E12 et disséqué à E14, le site d'électroporation est indiqué par la fluorescence épicentrale verte à E14. L'expression de la GFP est observée dans le thalamus, le préthalamus et l'hypothalamus, ce qui indique que les territoires destinés à mourir ont été transfectés avec succès. Le cadre en pointillés marque l'emplacement de la coupe à travers une zone ventriculaire.

Un examen plus attentif de la zone ventriculaire montre la migration des cellules GFP hors de la zone ventriculaire et vers la zone de la mantle. Là où se formeront les noyaux hypothalamiques, la rétine embryonnaire peut également être facilement électroporée, comme le montre cette coupe coronale d’un embryon de 16,5 jours (E 16,5) électroporé à E 15,5 avec PCIC. Ici, l’accumulation de cellules positives pour m-cherry est spécifique à la couche neuroblastique externe et n’est pas observée chez les cellules ganglionnaires rétiniennes positives pour B rrn trois B dans la couche des cellules ganglionnaires. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 minutes, en l’absence de complications imprévues.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'employer des techniques stériles adéquates, d'avoir la main ferme lors de la manipulation des embryons et de disposer à l'avance de tous les matériaux nécessaires avant d'endormir la femelle gestante. Après cette procédure, les embryons électroporés peuvent être laissés en vie jusqu'à l'âge adulte, moment auquel d'autres méthodes, telles que des tests comportementaux et fonctionnels, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la manière dont la manipulation de certains gènes dans l'embryon affecte la fonction neuronale chez l'adulte. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du développement du SNC pour explorer la fonction des gènes in vivo chez la souris.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment introduire de l'ADN étranger dans le tube neural embryonnaire. Plus précisément, nous vous montrons comment préparer une femelle gestante pour une intervention chirurgicale, exposer l'utérus, injecter de l'ADN et électroporer l'embryon.

N'oubliez pas que le travail avec l'isoflurane peut présenter des risques, et que des précautions telles qu'un système de piégeage doivent être prises lors de la réalisation de cette procédure.