Réponses Analyse des souris neurones sensoriels olfactifs Utilisation de l'enregistrement Electroolfactogram Air-phase

Un prélèvement d'épithélium olfactif est monté sur une boîte et placé dans un courant d'air humidifié. Sous un microscope stéréo, une électrode de référence est reliée électriquement au tissu par l'intermédiaire d'une solution tampon. Une électrode d'enregistrement est positionnée à la surface de l'épithélium olfactif.

L'épithélium olfactif est stimulé par des bouffées d'odeurs contrôlées par ordinateur, administrées dans un flux d'air humidifié, qui transporte les odeurs jusqu'à l'épithélium olfactif. Les signaux EOG sont transmis via un amplificateur et un numériseur vers l'ordinateur d'enregistrement. Bonjour, je suis Catherine Ciar du Laboratoire d'hygiène XO du Département de biologie de l'Université Johns Hopkins.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant d'enregistrer l'électro-olfactogramme chez la souris. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les réponses des neurones sensoriels olfactifs aux odeurs. Commençons donc.

L'appareil d'enregistrement est composé d'une électrode d'enregistrement, d'une électrode de référence, d'un tube d'acheminement d'air, d'un support d'échantillon et d'un microscope stéréo, le tout fixé sur une table anti-vibrations située à l'intérieur d'une cage de Faraday. Des micromanipulateurs sont utilisés pour positionner les électrodes dans le tube d'acheminement d'air. Un flux d'air continu est fait barboter à travers de l'eau distillée afin d'ajouter de l'humidité, avant de passer par le tube d'acheminement d'air et de traverser l'échantillon.

Une boîte de culture de 60 millimètres remplie de sard destiné à l'adaptation de six à huit millimètres est utilisée comme surface de montage pour l'échantillon. Une cavité et un canal sont creusés dans ce support de la boîte de montage. Cela permet d'établir une connexion électrique entre l'électrode de référence et l'échantillon au moyen d'une solution de Ringer modifiée.

Les électrodes d'enregistrement et de référence sont connectées à un amplificateur. Les signaux provenant de l'amplificateur sont envoyés à un numériseur, puis à un ordinateur. Le logiciel XI graph est utilisé pour contrôler le protocole de stimulation, enregistrer le signal et analyser les réponses.

Un oscilloscope est connecté après l'amplificateur afin de surveiller en temps réel le potentiel électrique lors du positionnement de l'électrode d'enregistrement, ainsi que pendant les enregistrements de l'EOG. La délivrance des stimuli odorants est contrôlée par un pico-spritzer, qui est relié au même ordinateur utilisé pour l'acquisition du signal juste avant l'administration d'un stimulus odorant.

La sortie du pico-spritzer est reliée à un flacon contenant un odorant liquide. Ce flacon est ensuite connecté au tube d'acheminement de l'air. Voyons maintenant comment préparer les électrodes pour les expériences d'enregistrement.

L'électrode d'enregistrement est un fil d'argent chloruré dans une capillarité en verre étirée remplie de solution de Ringer modifiée. L'électrode de référence est un fil d'argent chloruré. Commencez la préparation des deux électrodes en insérant un fil d'argent dans le porte-électrode.

Pour l'électrode d'enregistrement, un à deux centimètres de fil doivent dépasser à l'extrémité du porte-électrode. On peut laisser un fil plus long pour l'électrode de référence. Pour appliquer le revêtement de chlorure d'argent, placer le fil dans une solution de chlorure de sodium à 0,1 molaire et relier le porte-électrode à la borne positive d'une source de courant continu de 1,5 à 9 volts.

La borne négative de la source d'alimentation doit être reliée électriquement à la solution de chlorure de sodium 0,1 molaire. Laisser la réaction du chlorure se poursuivre pendant 10 minutes afin d'équilibrer toute charge statique entre l'électrode d'enregistrement et l'électrode de référence. Toucher brièvement les électrodes l'une contre l'autre avant de les installer sur l'appareil d'enregistrement.

Ensuite, tirez une capillaire en verre à l'aide d'un tireur de micropipettes. L'ouverture à l'extrémité de la capillaire doit avoir un diamètre d'environ cinq à 10 microns. Utilisez un crayon en diamant pour marquer et casser l'extrémité émoussée de la capillaire afin qu'elle soit environ deux centimètres plus longue que le fil d'argent.

Utilisez un chalumeau au butane pour polir à la flamme l'extrémité coupée, puis faites fondre 0,5 % d'agros dans une solution de Ringer modifiée. À l’aide d’une pipette de transfert, aspirez une petite quantité de la solution d’agros fondue dans l’extrémité de l’électrode à l’aide d’une seringue qui a été chauffée et étirée pour présenter une extrémité longue et fine. Remplissez la micropipette étirée environ à moitié.

Avec la solution de Ringer modifiée, secouez doucement la pipette pour déloger les éventuelles bulles d'air. Conservez l'électrode remplie dans le flacon de stockage contenant une petite quantité de solution de Ringer modifiée au fond, jusqu'à son utilisation. Une fois l'échantillon de tissu préparé et prêt pour l'enregistrement, fixez une pipette remplie sur le fil de l'électrode d'enregistrement, les électrodes étant prêtes.

Examinons une expérience d'enregistrement afin de commencer à préparer le tissu pour l'enregistrement. Retirer la peau recouvrant le crâne d'une souris sacrifiée et sectionner soigneusement la tête en deux dans le plan médian. Monter une moitié de la tête, côté médial vers le haut, dans la boîte de montage. Retirer délicatement le septum afin d'exposer les cornets.

Placer la boîte contenant le tissu monté sur la platine d'enregistrement. Ajuster la platine de manière à centrer l'emplacement d'enregistrement sur les cornets sous le microscope. Ensuite, ouvrir le réservoir d'air pour délivrer de l'air humidifié à environ 600 millilitres par minute sur la surface du cornet.

Positionnez le tube d'acheminement de l'air de manière à ce qu'il se trouve à environ 10 millimètres du site d'enregistrement. Réglez l'amplificateur sur le mode continu (DC), car l'amplification alternative (AC) induirait des artefacts dans le signal EOG. Effectuez l'acquisition avec un filtre passe-bas de un kilohertz et un gain de 100 x.

Placez maintenant les électrodes d'enregistrement et de référence sur les micromanipulateurs. Abaissez l'électrode de référence dans la cavité du plat de montage et recouvrez-la de solution de Ringer modifiée afin qu'elle soit électriquement connectée au tissu. Abaissez soigneusement l'électrode d'enregistrement à la surface de la cornet deux B ou trois.

L'électrode doit effleurer légèrement la surface de l'épithélium olfactif. Lorsque l'électrode entre en contact avec l'épithélium, une ligne de base droite apparaît sur l'oscilloscope. Ensuite, fixez un flacon contenant l'odeur à l'orifice latéral du tube de distribution d'air sur l'ordinateur.

Initier un protocole de stimulation. La fréquence d'échantillonnage pour l'acquisition des données doit être de deux kilohertz ou plus. Le logiciel déclenchera une impulsion d'odeur et commencera l'enregistrement.

Un protocole de stimulation typique peut consister en une impulsion unique de 100 millisecondes, ou en des impulsions appariées de 100 millisecondes séparées par un intervalle d'une seconde, ou encore en une impulsion prolongée de dix secondes. Pour minimiser l'adaptation, prévoir un délai d'une à cinq minutes entre les protocoles après l'administration de concentrations élevées d'odeur. Une odeur résiduelle pouvant persister dans le tube, rincer le tube d'air avec de l'éthanol à 95 % et le faire sécher avant de continuer avec d'autres échantillons de tissu.

Le logiciel Axo graft fournit des outils permettant de mesurer des paramètres clés du signal EOG. Ces paramètres comprennent l'amplitude de la réponse, la latence, le temps pour atteindre le pic et les constantes de temps de terminaison. Plusieurs paramètres de l'EOG sont particulièrement utiles pour comparer les réponses normalisées entre souris, notamment l'amplitude de la réponse, le temps de montée de la latence, le temps pour atteindre le pic et la constante de temps de terminaison.

On observe ici des réponses des OG chez une souris suite à une stimulation par des concentrations croissantes d'acétate d'amyle liquide. La ligne noire en haut indique le moment et la durée de la stimulation olfactive. Ici, nous voyons une relation dose-réponse moyennée à partir de cinq souris ; les barres d'erreur correspondent à des intervalles de confiance à 95 %.

Une diminution de l'amplitude maximale est souvent observée à des concentrations olfactives très élevées. Un exemple de potentiel électro-olfactif en réponse à une stimulation par double impulsion est présenté : une seule impulsion brève d'agent odorant provoque une adaptation qui dure plusieurs secondes. On observe ici un potentiel électro-olfactif en réponse à une stimulation prolongée par un agent odorant durant 10 secondes.

L'EOG montre une désensibilisation lors de la présentation continue d'un odorant. Nous venons de vous montrer comment enregistrer le gramme du facteur électrode chez des souris. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de placer l'électrode juste à la surface de l'épithélium et de ne pas pénétrer au-dessous de la surface avec l'électrode.

Enregistrez toujours du même côté de la tête et évitez toute modification du dispositif afin de minimiser les variations. Maintenez le tissu humide, sans toutefois laisser s'accumuler de gouttelettes liquides. Placer le tissu sous un air humidifié immédiatement après la dissection permet de le conserver dans le meilleur état possible pour l'enregistrement. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.