Activités d'imagerie Odeur évoqués dans le bulbe olfactif de la souris en utilisant la réflectance optique et Signaux Autofluorescence

L'objectif général de cette expérience est de cartographier les activités induites par les odeurs à la surface du bulbe olfactif de souris à l'aide de signaux optiques intrinsèques et de signaux d'autofluorescence de flavoprotéines, ou imagerie FAS, après avoir anesthésié la souris et exposé le crâne. L'os situé au-dessus du bulbe olfactif est aminci. Un lambeau osseux est dessiné à l'aide de la pointe d'une lame de scalpel, puis retiré ; une chambre est réalisée en ciment dentaire et entoure la surface exposée du bulbe olfactif.

Il est rempli d’aros et une lame de couverture est placée au-dessus de cette préparation. Les cartes olfactives sont acquises séquentiellement chez la même souris à l’aide de signaux optiques intrinsèques et d’imagerie FAS. L’imagerie d’autres activités induites dans le bulbe olfactif de la souris, en utilisant la réflectance optique et les signaux d’autofluorescence, peut aider à répondre à des questions clés concernant la disposition spatiale des ordres dans le bulbe olfactif. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l’imagerie au glucose doublé ou l’IRMf, est de permettre l’enregistrement d’activités induites par ordre avec une résolution spatiale correspondant à un seul glomérule.

En général, les personnes novices dans ces méthodes éprouvent des difficultés au début de leur apprentissage, car les compétences chirurgicales et instrumentales s'acquièrent lentement. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle pour attirer l'attention sur les étapes cruciales des procédures chirurgicales et d'imagerie. Pincer la patte arrière de la souris afin de confirmer l'anesthésie et raser les poils du cuir chevelu à l'aide d'un tondeur.

Essuyez les poils résiduels sur la peau à l’aide de compresses stériles imbibées d’eau distillée. Placez la souris dans le cadre stéréotaxique de manière à ce que le museau soit dans le même plan que l’arrière de la tête. Afin de positionner le bulbe olfactif à l’horizontale, fixez fermement les barres nasale et auriculaire afin d’empêcher tout mouvement.

Appliquer un onguent ophtalmique sur les yeux afin d'éviter qu'ils ne s'assèchent pendant l'imagerie, puis désinfecter la zone du cuir chevelu avec de la Bétadine à l’aide de ciseaux stériles. Faire une incision à l’arrière de la tête entre les oreilles, puis couper de chaque côté vers la base de l’oreille et dans le sens antéro-postérieur vers le front en suivant les paupières. Terminer l’ablation du cuir chevelu en sectionnant la peau du museau.

En utilisant la barre nasale comme guide, positionnez l’animal sous un microscope stéréo et utilisez un coton-tige imbibé de solution saline pour détacher délicatement le périoste situé au sommet du crâne. Utilisez une pince pour enlever les tissus résiduels et grattez la surface du crâne avec un scalpel afin d’obtenir une préparation propre, permettant ainsi de maintenir l’aire du bulbe olfactif humide tout au long de l’expérience.

Placer un morceau de gélatine résorbable, une éponge imbibée d'eau distillée, sur l'os au-dessus du bulbe olfactif situé entre les yeux. Retirer l'éponge de gélatine et commencer par gratter délicatement l'os avec une lame de bistouri n°10. Maintenir un angle constant de 45 degrés entre la lame et l'os, et déplacer la lame depuis les paupières vers le côté sagittal de la région du bulbe.

Veiller à ne pas appliquer de pression verticale sur l'os ni rayer l'os au-dessus du sinus veineux pendant le processus d'amincissement. S'interrompre toutes les cinq minutes et poser une éponge de gélatine hydratée sur l'os pour refroidir la préparation. Tamponner le crâne avec l'éponge afin d'éliminer les particules osseuses et la poussière, et nettoyer périodiquement la pointe du scalpel pour la maintenir propre et aiguisée.

Continuez jusqu'à ce que la couche d'os spongieux ou trabéculaire soit visible. Lorsque la fine vascularisation du bulbe olfactif est visible, cessez de gratter l'os et utilisez la pointe d'un scalpel n°11 pour délimiter une zone rectangulaire entourant le bulbe olfactif. En gardant la fenêtre à l'intérieur des limites des sinus veineux, continuez à gratter l'os à l'intérieur de la zone rectangulaire.

Soit particulièrement prudent quant à la profondeur de la pointe du scalpel afin d'éviter tout contact avec la surface de la dure-mère. Pour évaluer l'épaisseur de l'os restant, appuie doucement avec la pointe d'une paire de forceps. Si l'os fléchit sous la pression, passe à l'étape suivante.

Ajoutez une goutte de solution saline et utilisez la pointe du scalpel orientée horizontalement pour soulever le lambeau osseux. Retirez soigneusement le lambeau à l’aide de pinces afin d’éviter d’arracher l’os restant. Une fois la surface du bulbe olfactif exposée, vérifiez l’absence de saignement ou de vaisseaux sanguins. Anastomose.

Essuyez la zone avec une éponge de gélatine imbibée de solution saline. Afin de maintenir le bulbe olfactif humide, appliquez un ciment dentaire au polyacrylate à l’aide d’une seringue de calibre 29 pour former un puits sur l’os autour de la fenêtre crânienne. Placez une goutte d’agarose à bas point de fusion sur la dure-mère et posez un verre de couverture stérile sur la fenêtre crânienne pour l’imagerie.

Placer le cadre stéréotaxique sous le microscope stéréo, en centrant la fenêtre crânienne dans le champ de vision afin de visualiser les capillaires. Passer à la lumière verte de 580 nanomètres et acquérir une image anatomique témoin pour vérifier l'état de la préparation pendant l'acquisition. Puis procéder à l'enregistrement des essais de stimulation, soit par imagerie du signal optique intrinsèque sous un éclairement de 630 nanomètres, soit par imagerie du signal d'autofluorescence des flavoprotéines sous un éclairement de 480 nanomètres. Une session d'imagerie standard comprend une période de base de cinq à 10 secondes, durant laquelle seul de l'air est administré, suivie d'une stimulation olfactive de trois à 10 secondes, selon la concentration d'odeur choisie.

Et enfin, une durée de 70 à 82 secondes d'apport d'air est enregistrée pour la récupération de la ligne de base. Ici, la vascularisation du bulbe olfactif est imagée à travers la fenêtre crânienne, suivie des résultats d'un essai de stimulation utilisant h sinal comme odorant, capturés à l'aide des imageries iOS et FAS. Par imagerie iOS, l'activité induite par l'odeur apparaît sous forme de zones sombres d'absorbance ; les zones activées par l'AL sont indiquées par des flèches blanches, et des zones actives peuvent être observées à la fois lors d'essais simples et lors de moyennes d'essais multiples.

Le passage à l'imagerie FAS chez la même souris montre maintenant l'activité induite en OD comme des zones blanches d'émission de fluorescence naturelle indiquées par les flèches noires, et peut également être observée à la fois dans des essais uniques et moyennés multiples. Remarquez que les zones noires d'absorption observées en imagerie iOS et les zones blanches d'émission de fluorescence naturelle observées en imagerie FAS se superposent. Cette concordance spatiale confirme que les deux techniques permettent la visualisation des mêmes glomérules olfactifs. Une fois l'ordre d'acquisition maître établi, les activités induites peuvent être enregistrées à l'aide de signaux de réflectance optique et de fluorescence naturelle en une heure pour la chirurgie et quelques heures pour l'acquisition d'images.

Les principaux inconvénients liés à l'utilisation de ces méthodes d'imagerie optique sont qu'elles ne permettent pas de visualiser les cartes olfactives chez des souris en libre mouvement. En outre, en raison de la pénétration limitée des photons dans les tissus biologiques, elles n'offrent pas un accès aux glomérules olfactifs ventraux après leur développement dans les années quatre-vingt-dix, lors de l'enregistrement des signaux intrinsèques dans le système olfactif. Peut-être une voie pour les chercheurs dans le domaine de l'imagerie optique consiste-t-elle à explorer les caractéristiques du revêtement particulier de l'odeur.

Dans le bulbe olfactif, l'imagerie de la fluorescence autofluorescente des flavoprotéines est une technique prometteuse permettant d'obtenir de nouvelles informations sur l'organisation spatiale des OD à l'aide de signaux optiques endogènes.