Isolement du labiles complexes multi-protéiques par des In vivo Contrôlée Cellulaire réticulation et chromatographie d'affinité immuno-magnétiques

Pour la réticulation, suivie d'une immunoprécipitation. Les cellules à une densité de 80 à 90 % sont incubées avec du DSP à une concentration d'un millimolaire, froid sur glace, dans du PBS, sans calcium, sans magnésium, ni DMSO.

Témoin du véhicule. Le DSP est un agent de réticulation bifonctionnel, perméable à la membrane et réductible, qui réticule les groupes libres situés à moins de 12 angströms l'un de l'autre. Après la réticulation, les cellules sont lysées et des immunoprécipitations sont réalisées en utilisant des témoins standards.

Les complexes protéiques sont ensuite séparés par électrophorèse SDS-PAGE en conditions réductrices, les agents réducteurs clivant le DSP, permettant ainsi l'identification des protéines individuelles par immunoblot. Salut, je suis Stephanie Ick du laboratoire du Dr Victor Fonde du Département de biologie cellulaire de l'Université Emory. Et moi, c'est Pearl Ryder, également du laboratoire Fonde.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'isolement de complexes de myprotéines utilisant une réticulation contrôlée suivie d'une chromatographie d'affinité immunomagnétique. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les interactions protéiques transitoires et labiles. Commençons donc.

Commencez par étiqueter le fond des plaques cellulaires afin d'indiquer le type cellulaire et la condition expérimentale spécifique. Un symbole positif ici indique un traitement par DSP, incluant un contrôle négatif avec véhicule DMSO uniquement. Ajoutez du milieu aux plaques pour les préparer en vue du semis cellulaire.

Des cellules HEK ensemencées à une dilution de un à cinq afin de permettre l'isolement de 500 microgrammes de protéine par réaction standard en tube. Un seul tube peut suffire à identifier les partenaires de liaison putatifs d'une protéine d'intérêt par immunotransfert à partir d'une analyse en spectrométrie de masse. Augmenter le nombre de réactions standard d'au moins dix fois.

Préparez également des stocks de la plupart des solutions utilisées dans l'expérience de réticulation. Ces solutions comprennent le PBS supplémenté en chlorure de calcium à 0,1 millimolaire et en chlorure de magnésium à un millimolaire, appelé PBS calcium magnésium. L'ajout d'ions calcium et magnésium est essentiel pour l'adhérence des cellules à la plaque de culture.

Pendant le déroulement de l'expérience, conserver la solution à quatre degrés Celsius. Les autres stocks comprennent la solution de blocage du réactif de réticulation, le cocktail d'inhibiteurs de protéases complet 50 X, que l'on vortexe toutes les 20 minutes jusqu'à dissolution du culot. Le Triton X-100 à 20 %, qui est conservé à quatre degrés Celsius et doit être utilisé dans un délai d'un mois, ainsi que les solutions tampon A 10 x et 1 x.

Préparez et conservez toutes les solutions comme indiqué dans le protocole écrit accompagnant. Enfin, préparez le tampon de lyse composé de tampon 1 X, plus 0,5 % de TRITTON X 100, et le tampon de précipitation immunomagnétique ou tampon IP composé de tampon 1 X.

Ajouter 0,1 % de TRITON X-101 deux jours après le semis, lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 %, ce qui est optimal pour la réticulation. Dans des conditions de forte confluence, les cellules ont tendance à s’empiler, ce qui réduit l’accessibilité du réticulateur perméable aux cellules. Remettre les plaques dans l’incubateur jusqu’au moment de la réticulation.

Préparez la solution de réactif de réticulation DSP juste avant de l'appliquer aux cellules. Le DSP est fortement hydrophobe et est donc dissous dans le DMSO à une concentration de 100 millimolaire avant d'être dilué dans le tampon PBS contenant du calcium et du magnésium. Pour améliorer davantage la dilution du DSP dans le tampon PBS calcium magnésium, chauffez un volume approprié, puis ajoutez 10 microlitres de la solution mère de DSP dans le DMSO.

Pour chaque millilitre de PBS chaud contenant du calcium et du magnésium, ajoutez la solution mère de D-S-P-D-M-S-O goutte à goutte avec un mélange répété jusqu'à ce que tout le DSP soit dissous. Préparez également une solution témoin véhicule contenant 10 microlitres de DMSO pour chaque millilitre de PBS calcium magnésium. Après dilution du DSP, conservez toutes les solutions de PBS calcium magnésium dans un bain d'eau glacée pendant une durée maximale de 10 minutes.

Ensuite, préparez un bain d'eau glacée capable d'accueillir toutes les plaques utilisées lors de l'expérience. Sortez les plaques de culture contenant les cellules de l'incubateur à 37 degrés Celsius et placez-les immédiatement dans le bain d'eau glacée. Lavez les cellules deux fois avec du PBS froid contenant du calcium et du magnésium, en utilisant les mêmes volumes préparés précédemment pour l'incubation avec l'agent de réticulation ; pour une plaque à six puits, prévoir deux millilitres par puits, et ainsi de suite.

Après le deuxième lavage, ajouter soit le témoin véhicule, constitué de DMSO dissous dans le tampon, soit la solution tampon de réticulation DSP aux cellules. Incuber sur glace pendant deux heures et vérifier environ toutes les 20 minutes afin de s'assurer que toutes les cellules sont recouvertes de solution. Si certaines cellules deviennent exposées, incliner et faire tourner la boîte pour les recouvrir uniformément à nouveau. Il est normal qu'une petite quantité de DSP précipite.

Pendant l'incubation de deux heures avec les cellules, avant la fin de cette période, préparez une solution de blocage à 1 × DSP en diluant le réactif dans du PBS contenant du calcium et du magnésium. Conservez la solution sur de la glace jusqu'à son utilisation pour arrêter la réaction de réticulation, en inactivant le DSP qui n'a pas réagi. Au terme des deux heures, retirez des cellules les solutions de contrôle véhicule et de réticulation.

Ajouter la solution de blocage DSP glacée et incuber sur glace pendant 15 minutes. Pendant ce temps, diluer le stock de cocktail d'inhibiteurs de protéases complet au 1/50 dans le tampon de lyse cellulaire. Une fois les 15 minutes écoulées, laver les cellules deux fois avec du PBS contenant du calcium et du magnésium.

Ensuite, ajoutez le tampon de lyse contenant les inhibiteurs de protéases aux cellules et agitez à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Après 30 minutes de lyse cellulaire, utilisez un grattoir à cellules pour recueillir les cellules à partir de la plaque. Veillez à maintenir les lysats sur de la glace afin de minimiser l'activité des protéases.

Faire centrifuger les lysats cellulaires pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius dans une microcentrifugeuse de table à vitesse maximale de 15 000 G. Prélever le surnageant à l’aide d’une pipette et le transférer dans un tube propre, puis jeter le culot. Analyser les concentrations protéiques à l’aide du dosage de Bradford et procéder à l’immunoprécipitation. Commencer à préparer l’immunoprécipitation immédiatement après avoir initié la réaction de réticulation de deux heures dans des tubes microcentrifuge de type vissable.

Combiner 30 microlitres de billes magnétiques anti-IgG avec 500 microlitres de tampon IP. Ajouter l'anticorps dirigé contre la cible d'intérêt. La quantité appropriée d'anticorps doit être déterminée pour chaque antigène individuel.

Dans des expériences préliminaires, les contrôles négatifs possibles pour les billes comprennent l'absence d'anticorps, les billes seules et les billes d'anticorps de contrôle d'isotype destinées à lier l'anticorps d'IP aux billes magnétiques. Incuber sur un agitateur rotatif pendant deux heures à température ambiante. À la fin de l'incubation, effectuer une courte centrifugation rapide des tubes, puis les glisser dans le support magnétique. Les billes s'accumuleront du côté du magnet.

Éliminer la solution contenant les anticorps non liés et laver immédiatement les billes afin d'éviter qu'elles ne s'assèchent. Après deux lavages, ajouter 500 microlitres d'un lysat cellulaire négatif ou positif pour DSP à une concentration d'un microgramme par millilitre dans les tubes appropriés. Un contrôle négatif par compétition au peptide peut être préparé à ce stade en ajoutant le peptide immunogène à une concentration déterminée lors d'expériences préliminaires la mixture de billes et de lysat.

Un autre contrôle négatif possible préparé à ce stade est une réaction sans lyzat, contenant uniquement du tampon, préparée en ajoutant 500 microlitres de tampon de lyse uniquement sur les billes. Resuspendre délicatement les billes pour les réactions expérimentales et de contrôle. Ne pas vortexer, car cela provoquerait la rupture des billes ; incuber à quatre degrés avec une rotation bout à bout pendant deux heures.

Au terme de deux heures, retirez le lysat à l’aide du support magnétique. Faites une courte centrifugation et lavez les billes un total de six fois avec un millilitre de tampon IP. Incubez chaque lavage à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Pour éliminer les complexes liés, ajouter un volume de tampon d'échantillonnage pour gel au tube d'IP juste au-dessus du culot de billes. Pour regrouper les billes au fond du tube, taper doucement le fond du tube afin de bien resuspendre toutes les billes dans le tampon d'échantillonnage pour gel. Alternativement, pour l'isolement par affinité immuno, ajouter 30 microlitres de tampon supplémenté avec le peptide immunogène aux billes.

La concentration requise du peptide immunogène est déterminée empiriquement. Après avoir testé une gamme de 10 à 200 micromolaire, incuber les billes à quatre degrés pendant deux heures, en tapotant les tubes toutes les 30 minutes. Utiliser le support magnétique pour récupérer les 30 microlitres contenant les complexes élus et les conserver dans un tube propre, puis laver les billes avec le tampon IP et conserver les billes.

Ajoutez un tampon d'échantillon pour gel au niveau des billes pour les deux méthodes d'élution. Chauffez les billes immunomagnétiques re-suspendues dans le tampon d'échantillon pour gel à 75 degrés Celsius pendant cinq minutes, en plus de la dénaturation des protéines. Cette étape permettra également de cliver la molécule DSP, autorisant ainsi la séparation des protéines individuelles dans l'analyse du complexe.

Les échantillons sur un gel SDS-PAGE destiné au transfert western blot. Les billes magnétiques immunologiques vides peuvent être éliminées par centrifugation et retirées de l'échantillon à l'aide d'un support magnétique avant le chargement. Si l'EIA d'affinité immunologique est dépourvue d'IgG, que ce soit par coloration protéique du SDS-PAGE ou par immunotransferts, elle convient à la spectrométrie de masse.

Voici un exemple de western blot de matériel provenant de lysats cellulaires réticulés et non réticulés, suivi d'une précipitation immunomagnétique à l'aide d'un anticorps monoclonal dirigé contre la sous-unité AP trois. La réticulation delta permet la détection de protéines interagissant qui ne sont pas visibles dans les échantillons non réticulés lors des isolations immunomagnétiques. Les contrôles négatifs montrent l'absence de capture spécifique de protéines, utilisant des contrôles sans anticorps et des isotopes d'anticorps appariés, avec une IgG dirigée contre le récepteur de la transferrine, tant pour les échantillons non réticulés que réticulés.

Dans cet exemple, une élution par peptide d'affinité a été utilisée pour récupérer les protéines liées à l'anticorps d'IP. Remarquez que l'anticorps immuno est absent dans la fraction de surnageant et reste dans la fraction de lysat durant l'élution par peptide. Nous venons de vous montrer comment isoler des complexes MultiPro labiles à l'aide du réactif de crosslinking chimique DSP, suivie d'une purification par affinité immunomagnétique.

Lors de cette procédure, il est important de maintenir les cellules, les solutions et les lysats au froid afin de préserver les interactions labiles pendant la réticulation et de minimiser l'activité des protéases. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.