Analyse immunocytochimique des cellules souches pluripotentes humaines en utilisant un appareil Self-Made Cytospin

Bonjour, je m'appelle Rick Pasqua, étudiant au laboratoire d'ingénierie des cellules souches du Département des sciences chimiques et biologiques de l'Université de Virginie du Commonwealth. Dans cette vidéo, je vais montrer comment notre laboratoire utilise un appareil de centrifugation STO peu coûteux et fabriqué maison afin de créer une monocouche observable de cellules souches pluripotentes humaines pour la quantification des marqueurs de surface cellulaire. Étant donné que de nombreux protocoles immunochimiques sont adaptés à des cellules souches pluripotentes humaines cultivées en colonies sur des lamelles-chambre, des problèmes peuvent survenir lors de la caractérisation de l'expression des biomarqueurs au niveau cellulaire individuel.

Le fait d'avoir les cellules en monocouche facilite non seulement l'analyse visuelle de celles-ci, mais éventuellement aussi la quantification de leur expression. L'appareil sinus spin que nos laboratoires utilisent peut être construit à l'aide de matériaux présents dans la plupart des laboratoires, nécessite uniquement un petit échantillon de cellules et ne requiert aucun réactif spécifique. Et plus important encore, il permet de reproduire de manière fiable une dispersion de cellules isolées pour l'observation. Voici quelques éléments dont vous aurez besoin pour construire l'appareil à cytosine.

Des lames en plastique, car celles-ci n'ont pas nécessairement besoin d'être propres ; vous pouvez utiliser d'anciennes lames à chambre si vous le souhaitez. Des lames en verre préalablement nettoyées. Celles-ci doivent être nettoyées car c'est sur elles que la monocouche cellulaire sera formée.

Papier filtre, n'importe quel type convient, et des embouts de micropipette. Les embouts de 1 à 10 microlitres sont ceux utilisés dans notre laboratoire avant le début de la construction. Des trous doivent d'abord être faits dans les lames en plastique.

Cela peut être réalisé à l’aide d’une perceuse à colonne. Le diamètre des trous dépend de la taille de la pipette micrométrique et doit correspondre à la largeur de la section la plus large de la pointe utilisée pour une pipette micrométrique standard allant de un à dix microlitres. Ce diamètre doit être d’environ sept millimètres.

La quantité de trous que vous créez dans les lames en plastique dépend entièrement de leur utilisation prévue. Par exemple, pour la coloration immuno-chimique dans notre laboratoire, nous utilisons généralement deux trous, un pour la coloration positive et l'autre pour le contrôle négatif du fond. Ces lames peuvent être réutilisées un nombre indéfini de fois.

Pour le papier filtre, découpez simplement un morceau aux dimensions de la lame en plastique. Utilisez les trous de la lame comme repère pour percer des trous dans le papier filtre. La taille du trou dans le papier filtre doit être suffisamment grande pour que la pointe de micropipette s'insère fermement, comme illustré ici.

Nous devons ensuite découper le nombre approprié de pointes de micropipette, une pour chaque trou, à environ la moitié de leur longueur. Elles serviront de base à la lame de verre sur laquelle sera créée la monocouche cellulaire. Ensuite, le papier filtre sera placé par-dessus.

Le papier filtre servira à absorber tout excès de milieu provenant de la coloration par suspension. Celui-ci sera ensuite recouvert par la lame en plastique, qui servira de support solide à l'appareil. On peut ensuite sceller les quatre côtés avec du ruban adhésif ordinaire.

Enfin, des embouts de micropipette entiers sont insérés dans les extrémités coupées de l'appareil. C'est à cet endroit que seront placés les échantillons cellulaires après la coloration en suspension. Il pourrait également être utile de marquer initialement l'emplacement des extrémités coupées sur la lame de verre afin d'en faciliter la reconnaissance.

Le protocole d'immunomarquage en suspension utilisé dans notre laboratoire consiste d'abord à récolter les cellules souches sous forme de suspension monocellulaire, généralement réalisée par dissociation enzymatique à l’aide de trypsine ou de tampons de dissociation cellulaire non enzymatiques à base d’EDTA. Les cellules sont ensuite transférées dans des tubes microcentrifugeurs de 1 ou 2 ml contenant leur milieu de croissance standard. Elles sont ensuite centrifugées à 200 ×g pendant quatre minutes.

La même vitesse de centrifugation sera utilisée pour tous les lavages et étapes de centrifugation ultérieurs. Le milieu est ensuite aspiré manuellement ; faites très attention lors de l'aspiration afin de s'assurer que le culot cellulaire reste intact. Ce culot est ensuite lavé deux fois avec un ml de PBS, en centrifugant et en aspirant à chaque fois.

L'étape suivante consiste à fixer les cellules à l'aide de réactifs de paraformaldéhyde (PFA) à 4 %, nécessaires pour cette étape ou indiqués dans le texte accompagnant cette vidéo. Les cellules sont incubées dans la solution de paraformaldéhyde à 4 % et laissées à température ambiante pendant 10 minutes. Il est recommandé d'effectuer cette étape avant la suspension extracellulaire et la coloration destinée à l'utilisation de l'appareil cyto-centrifuge.

Ensuite, les cellules sont lavées deux fois avec du PBS pour éliminer les traces de PFA. Les cellules doivent alors être bloquées afin d'éviter une coloration non spécifique. Après les lavages au PBS à l'étape précédente, aspirez le liquide de lavage et ajoutez un ml de solution de blocage.

Laisser ensuite à température ambiante pendant environ 45 minutes. Pendant l'attente de la solution de blocage, vous pouvez préparer l'anticorps primaire en le diluant à la dilution recommandée dans la solution de blocage. Conserver cette solution à quatre degrés Celsius.

Une fois les cellules incubées dans la solution de blocage pendant environ 45 minutes, centrifuger et aspirer cette solution, puis les resuspendre dans la solution d'anticorps primaire. À des fins de détection de la liaison non spécifique et de contrôle du fond, il est préférable de conserver au moins un échantillon comme témoin négatif, auquel aucun anticorps primaire n'est ajouté et qui est simplement resuspendu dans du PBS.

Tous les échantillons sont laissés à température ambiante pendant environ une heure. Si désiré, les cellules fixées peuvent être conservées en suspension dans la solution d'anticorps primaire toute la nuit et lavées deux fois avec la solution de blocage. La solution d'anticorps secondaire peut être préparée pendant le lavage.

Les anticorps secondaires sont généralement sensibles à la lumière, il est donc conseillé, si possible, d'atténuer l'éclairage du laboratoire et de recouvrir les récipients utilisés de papier d'aluminium afin d'éviter le blanchiment de la fluorescence. Les réactifs antifa peuvent être intégrés au protocole, mais leur utilisation doit être soigneusement surveillée car ils peuvent entraîner un fond élevé, comme pour l'anticorps primaire dilué à la concentration recommandée dans la solution de blocage. Appliquer une vis à tous les échantillons, qu'un anticorps primaire ait été ajouté ou non, une fois le lavage terminé.

Laisser reposer dans un endroit sombre, par exemple à l’intérieur d’un bocal, pendant environ une heure. Laver les cellules deux fois avec un ml de solution de blocage. Les cellules doivent maintenant être prêtes pour la coloration nucléaire avec le colorant DPI.

Préparez la solution de DPI à une dilution de un sur 10 000 dans du PBS au départ, lavez les cellules une fois avec un ml de PBS, puis resuspendez-les dans le DPI et laissez reposer à température ambiante pendant environ cinq à dix minutes. Comme pour l'anticorps secondaire, le DAPI est sensible à la lumière ; apportez donc les ajustements nécessaires pour éviter le blanchiment de la fluorescence. Lavez une fois avec un ml de PBS, puis finalement resuspendez.

Resuspendre à nouveau dans 1 ml de PBS. Ce mélange devrait alors être prêt à être utilisé avec un appareil cyto-centrifugeuse. Placer au maximum 100 microlitres de la solution de cellules uniques dans la partie supérieure des embouts de micropipette.

Une quantité moindre est toutefois recommandée afin d'éviter un trop-plein ou des gouttes. Ensuite, placer un appareil de cytocentrifugation et le contrepoids dans une centrifugeuse de table et centrifuger à 1000 tr/min pendant quatre minutes. Par la suite, démonter soigneusement l'appareil de cytocentrifugation de manière à minimiser le risque de détachement des cellules de la lame de verre.

Vérifiez que l'immobilisation a eu lieu sous microscope à fluorescence avant le montage. Ce sont des images d'une monocouche de cellules BG one V marquées avec quatre marqueurs de surface cellulaire SSCA provenant de l'appareil cyto-centrifugeuse. Remarquez à quel point les cellules sont isolées les unes des autres, permettant ainsi l'observation et l'enregistrement de cellules individuelles.

Ce qu'il y a de bon dans ce protocole, c'est qu'il permet de reproduire une monocouche de cellules réalisable, rentable et facilement adaptable à toute analyse de routine des cultures de cellules souches. J'espère donc que vous tirerez profit de cette vidéo et que vous trouverez le protocole utile pour vos propres recherches.