Analyse de cellules souches pluripotentes en utilisant cryocoupes de corps embryoïdes

Première partie, Introduction. Bonjour, je m'appelle Rafael. Je suis post-doctorant au laboratoire du professeur Stevens Hans à l'Université fédérale de Rio de Janeiro au Brésil.

Bonjour, je m'appelle Ismail. Je suis assistant de recherche et également professeur. Dans cette vidéo, nous allons montrer comment préparer des coupes claires de corps d'androïdes.

Commençons. Deuxième partie, matériaux et équipements. Pour cette procédure, nous aurons besoin d'un milieu d'inclusion pour les spécimens congelés.

Solution de paraformaldéhyde à 4 % pour la fixation des cellules, solutions de saccharose pour la protection cryogénique. Une aiguille à extrémité légèrement courbée, un microscope stéréo pour une meilleure visualisation de l'EBS et un agitateur. Partie trois.

Ici, les embryons humains sont cultivés dans des plaques de culture non adhérentes. À l’aide d’une pipette, nous regroupons tous les embryons aussi près que possible afin de les transférer dans un tube conique de 15 millilitres. Les EBS sont soigneusement récoltés et transférés dans le tube.

Il est important de récupérer tous les EBS, car la quantité de matériel est faible. Une fois les EBS décantés, le milieu de culture est soigneusement éliminé. Vous devriez pouvoir voir le culot au fond du tube. Nous pouvons maintenant passer à la procédure de fixation.

Les EBS seront fixés dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS ou solution saline tamponnée au phosphate. Il est important de resuspendre le culot avec la solution de PFA. Les EBS sont ensuite fixés dans la solution de fixation pendant 30 minutes.

Après la fixation, la solution de PFA est soigneusement éliminée. En prenant soin d'éviter de remettre en suspension les EBS, on la remplace par une solution de 10 % de saccharose dans du PBS afin d'initier la cryoprotection des EBS ; le matériel est conservé pendant 30 minutes dans cette solution. Ensuite, nous retirons soigneusement la solution de 10 % de saccharose et remettons en suspension les EBS dans une solution de 20 % de saccharose.

Une fois de plus, les EBS sont conservés pendant 30 minutes dans cette solution. Enfin, la solution de saccharose à 20 % est retirée et remplacée par une solution de saccharose à 30 % dans le PBS, où ils sont maintenus encore 30 minutes. Nous pouvons maintenant procéder à l'orientation et au blocage des EBS.

Dans notre laboratoire, nous utilisons des gélules vides comme moules. Pour le blocage des EBS, il est important de recouvrir les parois internes de l'embout avec une solution de saccharose avant de recueillir les EBS. Nous pouvons maintenant recueillir soigneusement les EBS et attendre qu'ils se déposent au fond de l'embout.

Ensuite, les EBS sont placées au centre du bloc. Celle-ci doit être la position finale des EBS à l'intérieur du bloc. À l'aide d'un microscope stéréo et d'une pointe fine, nous recueillons et éliminons autant que possible de solution de saccharose.

Veiller toujours à ne pas prélever les EBS. À l’aide d’une aiguille dont la pointe est légèrement recourbée, tous les EBS sont positionnés au centre du bloc. Enfin, la solution de saccharose restante est absorbée à l’aide de morceaux de papier filtre.

Le positionnement précis de l'EBS à l'intérieur du bloc est très important pour obtenir des tranches de bonne qualité. Voici un exemple de mauvais positionnement de l'EB à l'intérieur de l'enveloppe. Après le positionnement de l'EBS et l'élimination de la solution de saccharose, l'enveloppe est remplie d'OCT en partant des bords, tout en veillant toujours à éviter que l'EBS ne flotte dans le Resus.

Les bulles restantes sont éliminées à l’aide d’une pipette, et les coquilles sont agitées pendant 15 minutes. Après agitation, le bloc OCT est congelé dans de la glace sèche.

À ce stade, vous pouvez soit stocker l'échantillon enveloppé dans du papier d'aluminium à moins 80 degrés Celsius en vue d'une analyse ultérieure, soit passer à l'étape du cryostat, partie quatre, sectionnement. Pour réaliser les coupes cryogéniques, vous aurez besoin d'un couteau jetable ou permanent, d'OCT et de lames en verre prétraitées au poly-L-lysine. Le bloc d'OCT est retiré du congélateur et conservé à l'intérieur du cryostat jusqu'à ce qu'il atteigne moins 20 degrés Celsius.

Le bloc est ensuite positionné sur le support et aligné parallèlement au bord de la lame. Les échantillons d'EB sont beaucoup plus petits que la plupart des autres échantillons de tissus, il est donc très important de s'assurer que toute la surface du bloc touche la lame en même temps, afin de minimiser la perte de matériau. Une fois positionné, le bloc est découpé en tranches de 10 micromètres, qui sont directement recueillies sur les lames en verre.

Les lames peuvent être stockées, de préférence à moins 70 degrés Celsius, ou peuvent également être utilisées le même jour. Le matériel peut être coloré pour une immunohistochimie ou une immunofluorescence. Conclusion. La méthode décrite ici fournit un protocole raisonnablement peu coûteux et facile à suivre pour obtenir des sections minces au cryostat de corps embryonnaires développés à partir de lignées de cellules souches humaines H nine ou murines US P one.

Les coupes cryogéniques obtenues peuvent être utilisées dans une grande variété de procédures afin d'analyser l'expression des protéines ou la morphologie des EB.