L'analyse des complexes protéiques par spectrométrie de masse Grande structurels

L'objectif général de l'expérience suivante est de caractériser de grands assemblages protéiques à l'aide de la spectrométrie de masse structurale. Cela est réalisé en préparant des capillaires plaqués or pour l'ionisation par électrospray en flux nanométrique. Dans un deuxième temps, l'échantillon est préparé et le spectromètre de masse est étalonné pour des mesures de masse élevée.

Ensuite, les conditions expérimentales sont optimisées afin de maintenir les complexes protéiques intacts en phase gazeuse. Les spectres de MS et de MS/MS sont ensuite obtenus. Les spectres de MS ont révélé des états de charge correspondant en masse au complexe intact, tandis que les expériences de MS/MS ont fourni le schéma d'association des monomères et des complexes dépouillés.

Bonjour, je suis Naam Kiba du laboratoire de Miron à l'Institut des sciences Whiteman, et je suis Isaac Ky. Je travaille également au laboratoire de Michelon. Aujourd'hui, nous aimerions vous présenter la procédure de base pour analyser de grands complexes protéiques à l'aide de la spectrométrie structurale. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour caractériser les complexes protéiques afin de définir leur géométrie tridimensionnelle, leur composition et leurs réseaux d'interaction. Commençons donc.

L'analyse des complexes protéiques non liés au courant est réalisée par la technique d'immunisation par pulvérisation aérienne en utilisant des capillaires emme plus ou a qua. Ce capillaire C peut être étiré jusqu'à une pointe fine d'environ un micron de diamètre, puis recouvert d'un matériau conducteur tel que l'or. Ces capillaires sont disponibles commercialement, comme vous pouvez le voir ici.

Cependant, son utilisation est nettement plus économique. Les capillaires en verre, euh, qui peuvent être refroidis et revêtus jusqu'à l'état prêt à l'emploi, sont soumis à un refroidissement sur cet appareil de regroupement d'aiguilles et à un revêtement sur cet appareil de revêtement, euh. Pour commencer cette procédure, fixez deux bandes de pad adhésif double face sur le fond d'une boîte de Pétri, en espaçant les bandes de deux centimètres.

Placer une tige en verre au centre de l'un des tampons adhésifs. Le tampon adhésif maintient les capillaires en place et la tige en verre soutient les capillaires préparés tout en empêchant leurs extrémités de se briser. Utiliser des capillaires en verre borosilicaté Boris d'un diamètre extérieur d'un millimètre et d'un diamètre intérieur de 0,78 millimètre.

Insérez un capillaire dans l'aiguille, regroupez délicatement le capillaire en place et ajustez sa position afin qu'il se trouve au centre du filament chauffant. Serrez doucement les pinces jusqu'à ce que les capillaires soient fermement maintenus aux deux extrémités. Tirez le capillaire à l'aide du programme prédéfini indiqué ici.

Cependant, rappelez-vous que le processus de programmation de l'étireuse repose sur des essais et des erreurs. Jusqu'à l'obtention d'une forme de pointe acceptable, chaque capillaire étiré donne deux capillaires finaux façonnés. Retirez les capillaires étirés de l'appareil et examinez les pointes, en écartant ceux qui sont déformés ou cassés.

Utilisez des pinces de positionnement émoussées pour placer les capillaires dans la boîte de Pétri. La base des capillaires est fixée au coussinet adhésif et la partie supérieure repose sur la tige de verre, avec la pointe orientée vers le haut. Continuez à tirer sur les capillaires jusqu'à ce que la boîte de Pétri soit pleine.

Environ 80 capillaires tiennent dans une boîte de 10 centimètres de diamètre. Ensuite, recouvrez les capillaires d'or. Insérez la plaque dans le pulvérisateur cathodique d'or.

Veillez à choisir l'alimentation en gaz conformément aux instructions du fabricant et activez un cycle de revêtement prédéfini. Le revêtement est répété de trois à six fois jusqu'à ce que les capillaires présentent une coloration dorée uniforme. Une fois les capillaires prêts, procédez à l'étalonnage du spectromètre de masse.

La plupart des expériences menées sur les complexes MultiPro sont réalisées à l’aide d’un spectromètre de masse à électrospray quadripolaire à temps de vol, comme celui-ci, fourni par Waters et modifié pour les hautes masses. Avant de charger l’échantillon protéique, étalonnez le spectromètre de masse à l’aide d’iodure de césium.

Préparez d'abord une solution de 100 milligrammes par millilitre de césium dans de l'eau purifiée ; le césium est utilisé pour l'étalonnage des masses élevées. Les agrégats de sels chargés simplement s'étendent sur une large plage de masse, du rapport masse sur charge de 393 à bien plus de 10 000. À l'aide de pinces émoussées, prenez un capillaire revêtu dans la boîte de Pétri et introduisez deux microlitres de la solution de césium dans le capillaire.

À l’aide d’une pointe chargée avec un gel einor, faire glisser la solution vers l’extrémité du capillaire, soit manuellement, soit à l’aide d’un adaptateur de centrifugation. Insérer le capillaire dans le porte-capillaire et l’ajuster de manière à ce que l’extrémité soit située à environ 10 millimètres du bord du support.

Placer la micropipette sous un microscope optique et utiliser une pince fine de type AA pour couper la pointe. Il est important de vérifier qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la micropipette, qui pourraient bloquer l’écoulement, et que la micropipette n’est pas obstruée. En outre, s’assurer que le revêtement en or n’est pas détaché de la micropipette.

Si tel est le cas, remplacez le capillaire ou taillez-en l'extrémité et retirez la section non revêtue. Ensuite, reliez le support de capillaire à l'interface ESI en écoulement nanométrique. Faites pivoter le stage XY, Z vers l'arrière afin d'éviter d'endommager le capillaire, puis poussez le stage en position activée.

Le capillaire doit être placé à une distance de un à dix millimètres de l'orifice du cône. Appliquez une tension capillaire et une pression d'écoulement nanolitrique faible jusqu'à l'initiation du spray. Ensuite, essayez de réduire la pression d'écoulement nanolitrique à une valeur minimale.

Optimisez l'intensité du signal en ajustant la position de la platine XYZ, la tension capillaire, la pression de débit nanofluide et le débit de gaz de désolvatation. Pour détecter une large gamme de masses des séries de pics saisonniers, les tensions d'accélération doivent être optimisées. Les paramètres utilisés ici sont une tension capillaire de 1,3 à 1,7 kilovolts, un cône d'échantillon de 80 à 150 volts, et un cône d'extraction de un à trois volts, afin d'optimiser la transmission des ions de haute masse, qui nécessitent des conditions de désolvatation douces.

La pression de contre-pression est augmentée à cinq à six millibars lors de la phase initiale sous vide entre la source et l'analyseur. Pour augmenter la pression de contre-pression, réduisez soigneusement la conductance de la ligne de vide de la source vers la pompe spirale en fermant partiellement la vanne d'isolement, tout en surveillant l'effet sur l'intensité du signal. Lors de la configuration complète des spectromètres de masse, effectuez environ 30 balayages à raison d'un balayage par seconde, dans une plage de rapport de charge maître comprise entre 1000 et 15 000, puis calibrez le temps de vol à l’aide de la table d’étalonnage appropriée après l’acquisition.

À présent que l'étalonnage est terminé, l'échantillon protéique peut être chargé. L'échantillon est préparé avant l'étalonnage du spectromètre de masse, et des concentrations micromolaires faibles sont requises. Si nécessaire, concentrer l'échantillon à l'aide de dispositifs de filtration ultrafacentrifuge.

Vérifiez que le complexe protéique n'est pas absorbé par la membrane du dispositif avant utilisation. En vérifiant le volume et l'absorbance UV, seules des solutions volatiles peuvent être utilisées pour la NESI, ce qui rend souvent nécessaire un échange de tampon. Une colonne de filtration sur gel en microcentrifugeuse peut être utilisée pour éliminer toute trace de sels, de molécules tampon ou de tout autre adduit non volatil.

Au lieu de cela, suspendre l'échantillon dans une solution aqueuse d'acétate d'ammonium. Cette étape critique détermine la qualité des spectres.

Répétez l'échange de tampon jusqu'à trois fois avec une dilution minimale, inférieure d'un facteur de 1,3 par dispositif, jusqu'à ce que l'échange maximal soit atteint. Si une concentration et un échange de tampon sont tous deux nécessaires, ils peuvent être effectués simultanément en utilisant la filtration ultra-centrifuge, comme indiqué au début de cette section. Ensuite, chargez l'échantillon comme illustré pour l'étalonnage au iodure de césium et démarrez la pulvérisation.

Commencez par une optimisation initiale du spray jusqu'à ce que le signal soit détecté. Utilisez l'équation pour l'état de charge moyen indiquée, dans laquelle M est la masse du complexe. En Daltons, toutefois, la position exacte des états de charge dépend de la protéine.

Pour éviter la dissociation du complexe, ne chauffez pas la source de fer. Éteignez le chauffage ou maintenez la température en dessous de 40 degrés Celsius. Faites varier la position du capillaire, ainsi que les tensions de la cone d'échantillonnage et de l'extracteur.

Pour maximiser la transmission du fer, un point de départ possible consiste à régler la tension du cône à 100 volts, celle de l'extracteur à 1 volt et la tension du capillaire à 1,5 kilovolt. Vérifiez le changement résultant dans les spectres. Optimisez ces paramètres conjointement avec une pression de débit nanofluide afin d'améliorer la désolvatation et d'éliminer l'eau résiduelle ainsi que les composants tampons.

Augmentez la tension de polarisation en fonction de la pression de gaz dans la cellule de collision. Les tensions de polarisation typiques se situent généralement entre 10 et 100 volts, avec un débit de gaz piégeur compris entre 1 et 10 millilitres par minute. Procédez avec précaution afin d'éviter l'association du complexe, et ajustez les énergies de collision de piégeage et de transfert.

Des tensions plus élevées, généralement comprises entre 10 et 30 volts, sont souvent nécessaires pour la transmission des ions de masse élevée. À ce stade, il est important d'éviter la dissociation induite par collision du complexe, comme illustré ici. Une fois qu'un signal stable est atteint, il est recommandé de réduire la pression de débit nanométrique et la tension capillaire à des valeurs minimales tout en maintenant un spray stable.

Après avoir collecté plusieurs analyses, procédez à l'identification des composants du complexe par spectrométrie de masse en tandem. Une fois qu'un signal optimal et stable a été obtenu pour le complexe protéique, sélectionnez un ion précurseur et réglez le centre de masse dans la largeur d'isolement. En général, utilisez une résolution de masse faible de 12 et une résolution de masse élevée comprise entre 13 et 15, avec une plage de masse large afin de détecter les produits de dissociation de haute masse et de faible charge, puis réduisez-la aux valeurs souhaitées pour effectuer la ms.

La spectrométrie de masse dissocie le précurseur ferrique en augmentant l'énergie de collision, abrégée en CE, et en élevant la pression dans la cellule de collision ; augmentez progressivement, par paliers de 10 à 20 volts, l'énergie de piégeage ou de transfert CE, et élevez la pression du gaz de collision de zéro à cinq millilitres par minute. Surveillez les modifications des spectres jusqu'à ce que les conditions d'activation optimales soient atteintes. Une énergie d'activation élevée peut induire la dissociation d'une ou plusieurs sous-unités à partir du complexe intact et permettre de préciser les affinités d'interaction entre les différentes sous-unités.

Sélectionnez plusieurs charges pour l'analyse MS. Dans le cas de composants superposés, l'acquisition d'un ensemble de spectres de MS en tandem aide à résoudre les séries de charges des différentes populations. De plus, les états de charge plus élevés se dissocient plus facilement par rapport aux états de charge plus faibles ; superposez le MS et le ms.

Spectres Ms pour valider l'isolement de l'ion précurseur choisi. En plus de la caractérisation du complexe intact par MS et ms. MS génère de plus petits sous-complexes en solution dans des conditions de dénaturation douce, et ces derniers doivent également être caractérisés.

L'analyse MS et ms MS de sous-complexes constitue la base pour définir l'architecture des sous-unités du complexe. Pour perturber partiellement les interactions entre sous-unités, ajoutez progressivement des solvants organiques jusqu'à une concentration de 50 % ou modifiez le pH de la solution en ajoutant de l'ammoniaque ou de l'acide formique jusqu'à une concentration de 4 %. Enfin, afin de déterminer les masses des sous-unités individuelles composant le complexe, il est important d'acquérir le spectre dans des conditions dénaturantes. Cette étape peut être réalisée à l'aide d'une pointe de type zip tip C quatre, en utilisant un rapport eau/acétonitrile de 25 à 75 avec 1 % d'acide formique comme solvant d'élution. Toutes les données recueillies doivent être traitées et analysées selon les instructions détaillées dans le protocole écrit joint. Avant de charger l'échantillon du complexe protéique, le spectromètre de masse est calibré à l'aide d'iodure de césium.

La série de pics également espacés, marqués en rouge, s'étend sur une large gamme allant d'un rapport de charge principal de 393 à bien plus de 10 000. Ils sont attribués à des agrégats salins simplement chargés de composition générale du complexe césium plus. Des signaux supplémentaires entre les pics principaux, marqués en noir, sont causés par des espèces doublement et triplement chargées de la série du complexe césium deux plus et du complexe césium trois plus.

Augmenter la pression à l'étape initiale de vide est essentiel pour détecter les agrégats de masse élevée. L'effet de la pression sur les pics de masse élevée est illustré ici à l'aide de valeurs de pression mesurées de 1,2 et 5,3 millibar. Le spectre de masse à la pression plus élevée est présenté ici en expansion.

Voici un exemple de spectrométrie de masse d'un complexe variant de lectine produisant une distribution des états de charge entre 3000 et 5 000 rapports masse/charge. Toutefois, en raison d'une désalinisation insuffisante des ions, les pics sont élargis. L'augmentation de la tension de polarisation de quatre à 15 volts, ce qui intensifie les conditions d'accélération, entraîne l'élimination des molécules d'eau résiduelles et des composants du tampon, conduisant à un spectre fortement résolu, dont la masse mesurée correspond à un complexe pentamérique.

L'état de charge +15 a ensuite été sélectionné pour l'analyse en spectrométrie de masse tandem. L'augmentation de l'énergie de collision provoque la libération d'un monomère fortement chargé centré à un rapport masse/charge de 1 664 et d'un complexe tétramérique dépouillé dans la plage de rapport masse/charge de 5 000 à 8 000. Le complexe de la variante de lectine a également été examiné en conditions dénaturantes, conduisant à l'association du complexe.

De cette manière, la masse exacte des sous-unités individuelles constituant le complexe peut être déterminée. Nous venons de vous montrer comment acquérir des spectres de masse (MS) et des spectres de fragmentation (MS/MS) d'ions de masse élevée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de préparer correctement votre échantillon et d'utiliser uniquement des tampons volatils compatibles avec la spectrométrie de masse.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.